徐 歡 黃 紀(jì) 孫胤富 王萬黨 張俊愛 徐軍發(fā)

活動性肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染性疾病，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，但細(xì)胞免疫在介導(dǎo)其發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。筆者前期工作中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性胸膜炎患者外周血及胸水中樹突狀細(xì)胞及其亞群髓樣性DC比例顯著高于正常對照組，且與IL-12水平呈正相關(guān)。BTLA與B7-H4是近年來發(fā)現(xiàn)的免疫檢查點(diǎn)抑制因子(immune checkpoint inhibitors)，表達(dá)在T細(xì)胞上的BTLA通過HVEM-BTLA信號途徑抑制T細(xì)胞的增殖、分化和多種細(xì)胞因子的分泌[1]。筆者前期研究中發(fā)現(xiàn)BTLA和B7-H4在肺結(jié)核患者外周血CD11c+抗原遞呈細(xì)胞中高表達(dá)，且表達(dá)BTLA和B7-H4的CD11c+APC活化同種T細(xì)胞的能力下降，提示BTLA和B7-H4對抗原遞呈細(xì)胞抗結(jié)核免疫有重要影響[2]。而mDC是CD11c+抗原遞呈細(xì)胞中最主要的細(xì)胞之一[3]。在體內(nèi)能活化初始T細(xì)胞的抗原遞呈，在固有性和適應(yīng)性結(jié)核免疫中發(fā)揮重要作用[4]。在活動性肺結(jié)核患者中，檢查點(diǎn)抑制分子BTLA和B7-H4對mDC的抗結(jié)核免疫的影響尚不清楚，本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)對46例診斷為活動性肺結(jié)核的患者外周血mDC中BTLA及B7-H4共表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，分析其與mDC表面成熟標(biāo)志分子CD83、抗原遞呈分子HLA-DR以及共刺激分子CD86表達(dá)的相關(guān)性，探究其臨床意義。

資料與方法

1.研究對象:46例活動性肺結(jié)核患者及23例健康對照均來自廣東醫(yī)科大學(xué)附屬厚街醫(yī)院。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠;②酗酒;③年齡<16歲或>65歲;④HIV陽性;⑤其他傳染病和慢性疾病(如糖尿病);⑥近1個月內(nèi)服用激素等治療的患者。根據(jù)抗結(jié)核藥物治療情況，本研究中將活動性肺結(jié)核患者分為抗MTB藥物治療前(prior treatment，PRT)組和治療后(post treatment，POT)組，其中，治療<3天者為治療前，治療2周者為治療后。本研究經(jīng)過廣東醫(yī)科大學(xué)附屬厚街醫(yī)院和廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，已征得研究對象的知情同意。

2.主要試劑和儀器:流式抗體分別為Lin1-FITC(為混合抗體，包括FITC標(biāo)記的CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56的抗體，克隆號是SK7、3G8、SJ25C1、L27、eMfP9、NCAM16.2)購自美國BD公司；BTLA-APC(MIH26，Biolegend)，B7-H4-P (H74，eBioscience)，CD83- PerCP-CyTM5.5(HB15，Biolegend)，CD11c- APC-eFluor780(BU15，eBioscience)，HLA-DR- PE-Cyanine7(LN3，eBioscience)，以及各自同型抗體均購自美國eBioscience公司。人淋巴細(xì)胞分離液購自美國GE公司，F(xiàn)ACS-CantoⅡ流式細(xì)胞儀型號為美國BD公司產(chǎn)品。

3.外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的分離：具體方法參考文獻(xiàn)[5]，肝素鈉抗凝血5ml離心1500r/min,5min，上清血漿與-80℃凍存；血液細(xì)胞與無菌0.9%氯化鈉溶液1∶1混合稀釋，將稀釋液緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上，室溫870×g離心30min，分離單個核細(xì)胞。

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測mDC共表達(dá)BTLA和B7-H4以及BTLA、B7-H4雙陽性mDC和 BTLA、B7-H4雙陰性mDC表達(dá)CD83、HLA-DR和CD86:取100μl含1×106個PBMC于流式管中，加入推薦量熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體(CD83-PerCP-CyTM5.5、HLA-DR- PE-Cyanine7、CD11c- APC-eFluor780、Lin1-FITC、BTLA-APC、B7-H4-PE、CD86-FITC)，以相同的方式各加入各自相應(yīng)同型抗體作為對照。振蕩混勻，4℃避光孵育30min；加入2ml洗滌液洗2次，棄上清；加入200μl 10g/L多聚甲醛溶液，輕輕混勻，4℃避光保存。24h內(nèi)上機(jī)檢測分析，采用FlowJo 7.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

結(jié) 果

1.BTLA和B7-H4在活動性肺結(jié)核患者外周血中高表達(dá):采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測APT患者外周血來源mDC中BTLA和B7-H4共表達(dá)情況。結(jié)果顯示患者外周血mDC中BTLA和B7-H4共表達(dá)水平顯著高于健康對照組(圖1A，P=0.000)，AUR=0.9282(圖1B)。

圖1 BTLA和B7-H4在活動性肺結(jié)核患者(APT)外周血mDC中高表達(dá)

2.BTLA和B7-H4在治療前后、初治與復(fù)治患者中DP-mDC表達(dá)情況：10例患者經(jīng)1個月治療后DP-mDC比例顯著下降(圖2A，P<0.01)。復(fù)治患者中表達(dá)顯著高于初治患者(圖2B，P<0.05)。

圖2 治療前后、初治與復(fù)治患者中DP-mDC表達(dá)情況

3.BTLA和B7-H4共表達(dá)mDC中CD83的表達(dá):健康對照組和APT外周血共表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC中表達(dá)CD83的陽性率均顯著高于不表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC(圖3中A、B，P=0.000)。但患者外周血中共表達(dá)和不表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC中CD83的表達(dá)高于健康對照組(圖3C，P<0.05)。

4.BTLA和B7-H4共表達(dá)mDC中HLA-DR表達(dá):健康對照組和患者組外周血共表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC中表達(dá)HLA-DR的陽性率均顯著高于不表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC(圖4中A、B，P=0.000)。但患者外周血中共表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC和不表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC中HLA-DR的表達(dá)均顯著低于健康對照組(圖4C，P=0.000)。

圖3 DP-mDC、DN-mDC中CD83的表達(dá)

圖4 DP-mDC、DN-mDC中HLA-DR的表達(dá)

5.BTLA和B7-H4共表達(dá)mDC中CD86表達(dá)：健康對照組和患者組外周血共表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC中表達(dá)CD86的水平顯著低于不表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC(圖5中A、B，P<0.01)。但患者外周血中共表達(dá)和不表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC中CD86的表達(dá)均顯著高于健康對照組(圖5C，P=0.000)。

圖5 DP-mDC、DN-mDC中CD86的表達(dá)

討 論

筆者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)共表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC在TP患者外周血中顯著高于健康對照組; APT外周血中DP-mDC的表達(dá)顯著高于健康對照組，復(fù)治患者中比例顯著高于初治患者，經(jīng)過1個月治療DP-mDC比例顯著降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在健康對照和患者外周血中，DP-mDC表達(dá)CD83和HLA-DR都顯著高于DN-mDC,而CD86在DP-mDC中的表達(dá)水平低于DN-mDC。APT外周血中DP-mDC和DN-mDC表達(dá)CD86和CD83水平都顯著高于健康對照組，但APT外周血中DP-mDC和DN-mDC表達(dá)HLA-DR的水平顯著低于健康對照組。以上結(jié)果提示BTLA和B7-H4在活動性肺結(jié)核中可能影響mDC的抗結(jié)核免疫。

樹突狀細(xì)胞(DC)在抗結(jié)核中發(fā)揮著重要作用，APT患者mDC上高表達(dá)BTLA和B7-H4可能介導(dǎo)結(jié)核桿菌的免疫逃逸，BTLA主要表達(dá)在T細(xì)胞和一些髓原性細(xì)胞上，表達(dá)在T細(xì)胞上的BTLA可與配體HVEM作用來抑制T細(xì)胞增殖與活化，并抑制T細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子[1]。在活動性肺結(jié)核患者CD4+和CD8+T細(xì)胞高表達(dá)BTLA，BTLA通過抑制T細(xì)胞的活性參與結(jié)核病的進(jìn)展[6]。在免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中Th1、Th2和Th17效應(yīng)T細(xì)胞上的BTLA表達(dá)與活動性疾病相關(guān),BTLA作為共抑制分子在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和疾病活動中發(fā)揮重要作用[7]。肝細(xì)胞癌中BTLA抑制T細(xì)胞功能參與其免疫進(jìn)程，免疫抑制分子BTLA有望成為新的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)[8]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，APT外周血CD11c+抗原遞呈細(xì)胞高表達(dá)BTLA，且BTLA的表達(dá)與CD11c+抗原遞呈細(xì)胞活化同種T細(xì)胞功能下降相關(guān)[2]。目前筆者的結(jié)果顯示DP-mDC在APT外周血中的表達(dá)顯著高于健康對照組，復(fù)治患者中比例顯著高于初治患者，經(jīng)過1個月治療DP-mDC比例顯著降低。提示在ATP中，結(jié)核桿菌可能通過升高BTLA來抑制mDC的功能，并且通過mDC高表達(dá)B7-H4來抑制T細(xì)胞的免疫活性，最終影響機(jī)體的抗結(jié)核免疫。經(jīng)治療后BTLA和B7-H4表達(dá)水平降低，BTLA對mDC的抑制作用也隨之降低, mDC通過B7-H4對T細(xì)胞的抑制作用也降低。

CD83分子是成熟DC細(xì)胞表面重要的標(biāo)志分子，參與DC細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。用結(jié)核菌體或菌體抗原體外刺激可誘導(dǎo)其成熟并且高表達(dá)CD83[9,10]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核性胸膜炎患者中mDC活化成熟，高表達(dá)CCR7和CD83[11]。BTLA不僅在T細(xì)胞的表面高表達(dá)，在成熟的DC細(xì)胞上也有表達(dá)。BTLA在T細(xì)胞上的表達(dá)可抑制其增殖活化和多種細(xì)胞因子的分泌。成熟DC細(xì)胞在高表達(dá)CD83的同時也高表達(dá)免疫負(fù)向調(diào)節(jié)因子，包括BTLA和B7-H4[12]，其在DC 細(xì)胞上的表達(dá)可能對其功能有影響。Kobayashi等[13]研究發(fā)現(xiàn)BTLA可抑制LPS刺激時DC和巨噬細(xì)胞的功能，BTLA-/-小鼠極易發(fā)生LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克。有研究發(fā)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的CCR7和BTLA過表達(dá)可增強(qiáng)未成熟樹突狀細(xì)胞的免疫耐受性和遷移[14]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，無論是APT還是健康對照組其外周血DP mDC 表達(dá)CD83的比例都顯著高于DN mDC，這些結(jié)果顯示APT外周血中DP mDC相對成熟，提示檢查點(diǎn)共抑制分子BTLA和B7-H4可能傾向于表達(dá)在成熟的mDC上，表達(dá)在成熟mDC上的共抑制分子一方面可抑制其進(jìn)一步的活化，最終抑制CD83的升高；另一方面可抑制T細(xì)胞的活化，大道維持mDC的免疫自穩(wěn)，目前，筆者也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ATP患者DP mDC和DN mDC表達(dá)CD83都顯著高于健康對照，提示ATP患者中的DC是相對成熟活化的，在機(jī)體的抗結(jié)核免疫中具有重要的作用。而BTLA和B7-H4在ATP患者mDC中高表達(dá)也進(jìn)一步地說明它們可能具有抑制mDC的免疫活性的特點(diǎn)。

抗原遞呈分子HLA-DR可遞呈抗原給T細(xì)胞，刺激T細(xì)胞的活化。成熟的DC也高表達(dá)HLA-DR。筆者的研究發(fā)現(xiàn)無論是APT還是健康對照組其外周血DP mDC表達(dá)HLA-DR的水平都顯著高于DN mDC，這同樣說明了DP mDC是相對成熟的DC，這提示檢查點(diǎn)共抑制分子BTLA和B7-H4傾向于在成熟活化的mDC上表達(dá)，其可能作用是對mDC免疫活性產(chǎn)生抑制，維持其免疫自穩(wěn)。筆者的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在APT外周血中DP mDC 表達(dá)HLA-DR顯著低于健康對照組，可能原因是患者外周血mDC高表達(dá)BTLA和B7-H4，高表達(dá)的BTLA和B7-H4可能抑制了mDC的免疫活性。結(jié)核菌或卡介苗感染抗原遞呈細(xì)胞后，HLA-DR的表達(dá)受到抑制[15]。結(jié)核菌感染小鼠模型中DC表達(dá)MHC-2也是降低的。這可能與結(jié)核菌感染導(dǎo)致mDC高表達(dá)BTLA有關(guān)，過高表達(dá)的BTLA可能抑制了DC表達(dá)HLA-DR。這可能是結(jié)核病患者DC免疫功能低下的一個原因。另一方面則通過增加B7-H4表達(dá)抑制HLA-DR對T細(xì)胞的激活作用。

CD86是在抗原遞呈細(xì)胞上表達(dá)的分子，在T細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮重要作用。筆者的研究發(fā)現(xiàn)正常對照組和患者組外周血共表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC中表達(dá)CD86的水平顯著低于不表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC，但患者外周血中共表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC和不表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC中CD86的表達(dá)均顯著高于健康對照組。有研究表明，結(jié)核菌感染后DC較高表達(dá)CD80和CD86[16]。筆者最近研究發(fā)現(xiàn)，在APT中表達(dá)BTLA的CD11c+抗原遞呈細(xì)胞CD86表達(dá)增加[2]。APT患者CD86表達(dá)的增高一方面可激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的殺菌作用；另一方面可能是對APT患者中DC功能降低進(jìn)行補(bǔ)償，達(dá)到抗結(jié)核作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示APT外周血mDC高表達(dá)BTLA和B7H4比例顯著升高，進(jìn)行有效的抗結(jié)核治療后，mDC共表達(dá)BTLA和B7-H4的比例明顯降低；高表達(dá)BTLA和B7-H4影響mDC的成熟以及HLA-DR的表達(dá)，提示在APT中BTLA和B7-H4可負(fù)向調(diào)節(jié)mDC的免疫活性，有可能是結(jié)核菌的免疫逃逸機(jī)制。BTLA和B7H4調(diào)節(jié)DC成熟的機(jī)制尚不清楚，共表達(dá)BTLA和B7-H4的mDC的免疫功能還有待于進(jìn)一步闡明。