熱孜萬古麗·烏斯曼 沙依拉·海米提 郭艷英
糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病,在世界范圍內(nèi)較為常見,且近年來發(fā)生率越來越高,嚴(yán)重威脅著人類的健康和生活質(zhì)量[1~3]。糖尿病主要發(fā)病機(jī)制有糖脂代謝異常、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等[4]。葡萄糖代謝紊亂是糖尿病癥狀中最突出的表現(xiàn),從胰島中產(chǎn)生和分泌的胰島素對(duì)于維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)起著十分關(guān)鍵的作用[5]。胰島由多個(gè)內(nèi)分泌細(xì)胞組成,主要包括α、β、δ和PP細(xì)胞,胰島內(nèi)分泌細(xì)胞中胰島β細(xì)胞占60%~80%,其能夠分泌并釋放胰島素[6]。胰島素是一種合成代謝激素,可增加細(xì)胞對(duì)血糖的吸收,從而降低血糖水平,而胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙是2型糖尿病的兩個(gè)主要病理與生理學(xué)特征[7]。
微小 RNA(microRNA,miRNA)是一類長(zhǎng)度為18~24 個(gè)核苷酸的非編碼低分子單鏈RNA,主要通過與靶基因mRNA 3′UTR 端結(jié)合來發(fā)揮作用,可以通過翻譯抑制或降解其靶mRNA來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[8,9]。大量研究表明,miRNA廣泛存在于組織和器官中,并且在多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中起到調(diào)控作用[10]。已發(fā)現(xiàn)許多轉(zhuǎn)錄因子和miRNA可調(diào)節(jié)胰島功能,miRNA在調(diào)控胰島素的分泌和抵抗、葡萄糖水平等方面均發(fā)揮重要作用[11~13]。本研究通過抑制或過表達(dá)MIN6細(xì)胞中miR-31-5p來檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖以及胰島素分泌的影響,并建立2 型糖尿病小鼠模型,通過給予尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor NC和miR-31-5p inhibitor來觀察小鼠胰腺組織變化,探討miR-31-5p在2 型糖尿病小鼠胰島素抵抗中的作用。
1.主要與材料:主要試劑與材料:MIN6小鼠胰島細(xì)胞株購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司,小鼠胰島素ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)ALPCO公司,LipofectamineTM2000、CCK-8試劑盒、HE染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司,鏈脲佐菌素和TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Simga公司,All-in-OneTMcDNA第一鏈合成試劑盒、All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司,基礎(chǔ)飼料與高脂高糖飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司,兔抗胰島素、兔抗Cleaved Caspase-3與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。80~90日齡的SPF級(jí)C57BL/6J小鼠由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(新)2018-0002。
2.細(xì)胞培養(yǎng):將MIN6小鼠胰島細(xì)胞株置于含10%胎牛血清、100μg/ml慶大霉素、100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,放在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%~90%時(shí),棄去培養(yǎng)基,用無菌的PBS清洗,加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞5min,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將MIN6細(xì)胞按照每孔 2×105個(gè)接種至 6 孔細(xì)胞板上,置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。實(shí)驗(yàn)分為Blank組(空白對(duì)照組)、miR-31-5p mimic 組(轉(zhuǎn)染 miR-31-5p mimic)、miR-31-5p mimic NC 組(轉(zhuǎn)染miR-31-5p mimic陰性對(duì)照)、miR-31-5p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-31-5p inhibitor)、miR-31-5p inhibitor NC組(轉(zhuǎn)染miR-31-5p inhibitor陰性對(duì)照)。miR-31-5p mimic、miR-31-5p inhibitor及miR-31-5p mimic/ inhibitor NC片段均由廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)并合成。Blank組正常培養(yǎng)不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 說明書操作,將Lipofectamine 2000分別與50nmol/L miR-31-5p mimic、100nmol/L miR-31-5p inhibitor和50nmol/L miR-31-5p mimic/inhibitor NC轉(zhuǎn)染至MIN6細(xì)胞中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4h后,更換新鮮RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h,收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
4.qRT-PCR:使用TRIzol試劑提取轉(zhuǎn)染后各組MIN6細(xì)胞,采用核酸蛋白檢測(cè)儀Nanodrop測(cè)定提取的RNA純度和濃度。以All-in-OneTMcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,以U6作為內(nèi)參基因,擴(kuò)增體系為:All-in-One qPCR Mix 10μl, cDNA 2μl, All-in-One miRNA qPCR Primer 2μl, Universal Adaptor PCR Primer 2μl, 50×ROX Reference Dye 0.5μl, 無酶水3.5μl。擴(kuò)增條件為: 95℃預(yù)變性10min,95℃ 20s,60℃ 30s,72℃ 10s,共40個(gè)循環(huán)。使用的引物序列由上海生工生物工程有限公司合成,具體引物序列如下:miR-31-5p上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAGGCAAGA-3′,下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′; U6 上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′,下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。
5.CCK-8:將成功轉(zhuǎn)染的各組MIN6細(xì)胞1×105個(gè)/孔接種至96孔板,分別在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 0、12、24、36、48、60、72h 后取出細(xì)胞,每孔加入10μl CCK-8溶液,孵育2h,按照 CCK-8 試劑盒說明進(jìn)行操作,在酶標(biāo)儀上450nm處檢測(cè)各孔細(xì)胞吸光度(A)值,繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖。
6.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定:將MIN6細(xì)胞以 5×104個(gè)/孔接種于24孔板內(nèi)并進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h棄去原有培養(yǎng)基,每孔加500μl無糖KRBH溶液,于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h。棄無糖 KRBH 溶液,換用含5mmol/L 葡萄糖的KRBH 溶液孵育1h后,4℃離心20min收集上清液,或換用20mmol/L 葡萄糖的KRBH溶液孵育1h離心收集上清液。將所收集的上清液放置于-80℃,按照胰島素ELISA試劑盒檢測(cè)胰島素的濃度,采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm波長(zhǎng)處的吸光值。
7.動(dòng)物造模:將60只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)、造模組(50只),并分別給予基礎(chǔ)飼料和高脂高糖飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后,隔夜禁食12h,造模組小鼠空腹腹腔注射鏈脲佐菌素 30mg/kg,正常對(duì)照組小鼠空腹腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,每天1次,連續(xù)3次。在末次注射3天后剪尾取血,采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定小鼠空腹血糖值(FBG),若FBG>11.1mmol/L且連續(xù)出現(xiàn)飲水量和尿量增多等現(xiàn)象則視為建模成功。選取造模成功的小鼠40只隨機(jī)分為NC組和miR-31-5p inhibitor組,每組 20只,NC組尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor NC(50mg/kg),miR-31-5p inhibitor組尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor(50mg/kg),每3天注射1次。正常組小鼠同時(shí)注射等量0.9%NaCl溶液,21天后測(cè)定各組小鼠FBG,并通過HE染色和免疫組化染色觀察胰腺組織的變化。
8.HE染色:以斷頭法處死各組小鼠,腹部解剖采集胰腺組織進(jìn)行HE染色。PBS沖洗材料,在4%多聚甲醛中固定,乙醇脫水,常規(guī)石蠟包埋,切成厚度為3μm的薄片。蘇木精染色5min,流水沖洗后,伊紅染色液染色3min,脫水、透明、封片,于顯微鏡下觀察并拍照。于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠胰腺組織病理學(xué)形態(tài)。
9.免疫組織化學(xué)染色:將石蠟切片脫蠟至水,采用0.01mol/L枸椽酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù),3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶,然后分別加一抗兔抗胰島素(1∶3000)與兔抗cleaved caspase-3(1∶200),4℃孵育過夜。次日使用 PBS 沖洗2次,每次3min,再加二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育15min,PBS 沖洗2次,DAB 顯色。經(jīng)過復(fù)染、脫水、透明、封片,在電子顯微鏡下觀察,進(jìn)行圖像采集與分析。
1.miR-31-5p對(duì)MIN6細(xì)胞增殖的影響:RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組MIN6細(xì)胞中miR-31-5p表達(dá)情況。與miR-31-5p mimic NC組比較,miR-31-5p mimic組miR-31-5p的表達(dá)量顯著增加(P<0.05),而miR-31-5p inhibitor組的表達(dá)量較miR-31-5p inhibitor NC組顯著降低(P<0.05,圖1)。CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明,與miR-31-5p mimic NC組比較,miR-31-5p mimic組MIN6細(xì)胞在轉(zhuǎn)染36h時(shí)細(xì)胞增殖能力顯著下降,在本研究的時(shí)間范圍內(nèi),這種趨勢(shì)保持到轉(zhuǎn)染后96h(P<0.05)。與miR-31-5p inhibitor NC組比較, 在轉(zhuǎn)染后24h時(shí)miR-31-5p inhibitor 組MIN6細(xì)胞增殖能力顯著提高,36、72和96h時(shí)也均高于miR-31-5p inhibitor NC組(P<0.05,圖2)。
2.miR-31-5p對(duì)MIN6細(xì)胞胰島素分泌的影響:分別用5mmol/L葡萄糖的KRBH溶液或20mmol/L葡萄糖的KRBH溶液刺激轉(zhuǎn)染的各組MIN6細(xì)胞1h后,ELISA檢測(cè)分泌胰島素含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,20mmol/L 葡萄糖的高糖刺激使胰島素分泌增加,而與miR-31-5p inhibitor NC組比較, 20mmol/L 葡萄糖的KRBH溶液刺激下,miR-31-5p mimic組MIN6細(xì)胞胰島素的分泌受到抑制(P<0.01),而miR-31-5p inhibitor 組胰島素的分泌量較miR-31-5p mimic NC組增加(P<0.01)。而在基礎(chǔ)糖濃度即5mmol/L 葡萄糖刺激下轉(zhuǎn)染 miR-31-5p mimic 或 miR-31-5p inhibitor的MIN6細(xì)胞胰島素的分泌水平?jīng)]有受到影響(表1)。
圖1 RT-PCR檢測(cè)各組MIN6細(xì)胞miR-31-5p表達(dá)水平與miR-31-5p mimic NC組比較,*P<0.05;與miR-31-5p inhibitor NC組比較,#P<0.05
圖2 CCK-8檢測(cè)各組MIN6細(xì)胞增殖情況與miR-31-5p mimic NC組比較,*P<0.05;與miR-31-5p inhibitor NC組比較,#P<0.05
表1 ELISA檢測(cè)各組MIN6細(xì)胞分泌胰島素量
與miR-31-5p mimic NC組比較,*P<0.01;與miR-31-5p inhibitor NC組比較,#P<0.01
3.miR-31-5p對(duì)2 型糖尿病小鼠胰島素抵抗的影響:小鼠空腹腹腔注射鏈脲佐菌素實(shí)驗(yàn)結(jié)束3天后檢測(cè)FBG,與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠的FBG明顯升高(P<0.01),達(dá)到15.87±3.34mmol/L,說明造模成功。進(jìn)行尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor NC與miR-31-5p inhibitor,21天后檢測(cè)FBG結(jié)果顯示,與miR-31-5p inhibitor NC組比較,miR-31-5p inhibitor 組FBG顯著下降(P<0.01,表2)。HE 染色結(jié)果詳見圖3,對(duì)照組(Blank)小鼠胰腺組織中胰島呈圓形或橢圓形,胰島內(nèi)細(xì)胞排列規(guī)則,細(xì)胞界限清晰且胞質(zhì)飽滿,染色均勻;miR-31-5p inhibitor NC組胰島發(fā)生萎縮,形態(tài)不規(guī)則,胰島細(xì)胞細(xì)胞核固縮,胞質(zhì)空泡增多,染色不均勻且部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)沉積;miR-31-5p inhibitor組胰島病理現(xiàn)象較miR-31-5p inhibitor NC組明顯改善,胰島形態(tài)改變較小,胰島細(xì)胞細(xì)胞核固縮程度減小,胞質(zhì)空泡較少,染色較為均勻。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)了各組小鼠胰腺組織,片鏡下陽(yáng)性反應(yīng)物呈棕黃色。對(duì)照組(Blank)小鼠胰腺中幾乎無裂解caspase-3的表達(dá),miR-31-5p inhibitor NC組胰腺中裂解caspase-3表達(dá)明顯,而miR-31-5p inhibitor組裂解caspase-3的表達(dá)較miR-31-5p inhibitor NC組明顯下降。與HE染色結(jié)果一致,胰島素免疫組織化學(xué)分析表明對(duì)照組(Blank)小鼠胰島為圓形,胰島細(xì)胞(免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞)主要分布于胰島中心部位,胞質(zhì)中充滿胰島素染色顆粒,均勻地散布于整個(gè)胰島且胞核不著色。miR-31-5p inhibitor NC組胰島形態(tài)被破壞,染色片中胰島素染色顆粒較少,細(xì)胞皺縮且排列分布不規(guī)則,有的胞質(zhì)中胰島素染色顆粒明顯減少呈空虛狀態(tài)。而miR-31-5p inhibitor組較miR-31-5p inhibitor NC組這些現(xiàn)象均有不同程度的改觀(圖4)。
表2 抑制miR-31-5p表達(dá)對(duì)2 型糖尿病小鼠FBG的影響
與正常對(duì)照組比較,*P<0.01;與miR-31-5p inhibitor NC組比較,#P<0.01
圖3 各組小鼠胰腺組織病理學(xué)形態(tài)(HE,×200)A.Blank;B.miR-31-5p inhibitor NC;C.miR-31-5p inhibitor
圖4 各組小鼠胰腺組織裂解caspase-3和胰島素的陽(yáng)性表達(dá)(IHC,×100)
1型糖尿病的特征是胰島β細(xì)胞逐漸凋亡從而導(dǎo)致胰島素的缺乏[14]。另外,胰島β細(xì)胞功能障礙在2型糖尿病的進(jìn)展過程中起著關(guān)鍵作用,研究表明2型糖尿病的患者體內(nèi)胰島β細(xì)胞數(shù)目減少[15]。因此,促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖與再生不僅是1型糖尿病的治療策略,也成為了2型糖尿病研究與治療的手段。
miRNA不僅在胰島β細(xì)胞增殖、凋亡、胰島素合成與釋放等過程中發(fā)揮作用,而且可以通過調(diào)控胰島素轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)而維持機(jī)體糖平衡,例如miR 7、miR 26、miR 236、miR 357等已被證實(shí)參與胰腺發(fā)育、胰島素合成與分泌等過程[16,17]。此外,也有報(bào)道指出,胰島β細(xì)胞團(tuán)與miRNA之間存在聯(lián)系,miRNA在胰島β細(xì)胞中具有細(xì)胞自主功能。例如,在懷孕或肥胖大鼠的胰島β細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)降低,特異性敲除胰島β細(xì)胞的miR-200可增加肥胖糖尿病小鼠β細(xì)胞的凋亡[18,19]。本研究通過將miR-31-5p mimic 與miR-31-5p inhibitor轉(zhuǎn)染到分化期的MIN6細(xì)胞中,以鑒定miR-31-5p是否影響MIN6細(xì)胞的增殖。研究結(jié)果表明,過表達(dá)miR-31-5p抑制MIN6細(xì)胞增殖而抑制miR-31-5p則促進(jìn)MIN6細(xì)胞增殖。由胰島β細(xì)胞分泌和釋放的胰島素能夠?qū)Ⅲw內(nèi)血糖維持在一個(gè)正常的水平,當(dāng)胰島β 細(xì)胞功能受損,胰島素分泌不足時(shí)會(huì)引發(fā)糖尿病[20,21]。因此,筆者探究了在20mmol/L 葡萄糖的高糖刺激下MIN6細(xì)胞的胰島素分泌水平,通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-31-5p mimic的MIN6細(xì)胞胰島素的分泌受到抑制,而轉(zhuǎn)染miR-31-5p inhibitor細(xì)胞的胰島素分泌量增加。由此說明,抑制MIN6細(xì)胞中miR-31-5p的表達(dá)有助于胰島β 細(xì)胞活性增加與胰島素分泌增加,從而起到降低血糖的作用。
2型糖尿病與肥胖密切相關(guān)。脂肪組織在葡萄糖代謝中起重要作用,能夠產(chǎn)生大量激素和細(xì)胞因子[22]。本研究通過高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg構(gòu)建2 型糖尿病小鼠模型,檢測(cè)到模型組小鼠的FBG達(dá)到15.87±3.34mmol/L,由此說明造模成功。接著對(duì)2型糖尿病小鼠進(jìn)行尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor NC與miR-31-5p inhibitor,21天后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-31-5p inhibitor 組FBG較miR-31-5p inhibitor NC組明顯下降。同時(shí),通過胰腺組織形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)注射miR-31-5p inhibitor NC的小鼠胰腺組織發(fā)生病理?yè)p傷,裂解的caspase-3明顯表達(dá),注射miR-31-5p inhibitor的胰腺組織病理?yè)p傷明顯改善,裂解的caspase-3幾乎沒有表達(dá),提示抑制miR-31-5p可有效改善 2 型糖尿病大鼠胰島素抵抗并改善胰腺病理?yè)p傷。
綜上所述,本研究證明了抑制miR-31-5p 表達(dá)可以促進(jìn)MIN6細(xì)胞的增殖,從而保護(hù)胰島的功能,有效改善糖尿病小鼠的空腹血糖。miR-31-5p可能成為治療2型糖尿病的重要的標(biāo)靶,為有效治療2型糖尿病提供了新的方法。后續(xù)研究將會(huì)深入探討miR-31-5p的作用靶點(diǎn)以及具體機(jī)制,為糖尿病的預(yù)防及治療提供可行的新思路。