王 博 黃啟晶 李佳欣 陳思琦 呂忠民 孫麗英 葛鵬玲

糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一類常見的由多種病因引發(fā)的內(nèi)分泌代謝性疾病，目前世界上有4.25億人患有糖尿病，預(yù)計2045年世界上將有6.29億人罹患糖尿病[1～3]。其中2型糖尿病發(fā)生率及致死率逐年升高，已被我國列入嚴(yán)重危害人民健康的重大多發(fā)病和常見病之一[4]。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指機體靶器官或組織對胰島素生物效應(yīng)的敏感度降低或喪失，是2型糖尿病發(fā)病的主要機制之一。

研究表明，PI3K/AKT通路中蛋白激酶B(AKT)活性降低是發(fā)生IR的病理基礎(chǔ)[5]。AKT活性可被NPS2390(鈣敏感受體拮抗劑)抑制，而GdCl3(鈣敏感受激動劑)能增強AKT活性[6]。因此，推測CaSR可能通過激活或抑制AKT的活性，進而調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響IR。本課題組前期實驗結(jié)果表明，肝臟、肌肉、脂肪及胰腺組織中均有CaSR的表達，各組織中發(fā)生IR時，AKT磷酸化位點Ser473和Thr308表達量降低，且CaSR基因及蛋白表達量均降低[7]。

目前西藥治療IR易產(chǎn)生治療矛盾，療效不理想，而中藥重視整體調(diào)節(jié)及辨證論治，且中藥治療具有多渠道、多靶點、毒性不良反應(yīng)小等特點。本實驗所用的花旗澤仁是臨床治療脾虛濕盛、濕熱內(nèi)蘊型糖尿病胰島素抵抗及相關(guān)疾病的經(jīng)驗方，療效確切[8]。本課題組前期實驗結(jié)果顯示，給予花旗澤仁后肝臟、肌肉、脂肪及胰腺組織中CaSR基因、蛋白及AKT表達量均顯著上調(diào)。

本研究根據(jù)前期體內(nèi)實驗證實CaSR與IR具有相關(guān)性的基礎(chǔ)上，將進一步在細胞水平上從CaSR角度，通過PI3K/AKT信號通路，探究花旗澤仁改善IR的作用機制，為花旗澤仁在臨床的應(yīng)用及推廣奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.實驗材料：L6肌細胞株購自ATCC(American Type Culture Collection)；健康SD大鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量200±20g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(黑)2013-004。分籠飼養(yǎng)，房間溫度為20±2℃，相對濕度為50%左右，自由攝食、飲水，適應(yīng)喂養(yǎng)1周。

2.藥物、試劑與儀器：DMEM，胎牛血清由美國Gibco公司提供；TNF-α由美國Peprotech公司提供；考馬斯亮藍由美國Sigma公司提供；DMSO由美國Sigma公司提供；Trizol Reagen由美國Invitrogen公司提供；DEPC焦炭酸二乙酯由美國Amresco公司提供；AccuPower RocketScript RT PreMix、AccuPower GreenStar qPCR PreMix由韓國Bioneer公司提供；無水乙醇、氯仿、異丙醇、甲醇、吐溫20由天津市致遠化學(xué)試劑有限公司提供；丙烯酰胺由上海埃彼化學(xué)試劑有限公司提供；Tris-HCl(pH 6.8)以及Tris-HCl(pH 8.8)由美國Amresco公司提供；RNase-free water (去離子水加入0.01%的DEPC)、10%十二烷基硫酸鈉(SDS)、DAPI、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒由中國Solarbio公司提供；N,N,N′,N′-四甲基二乙胺(TEMED)由美國Sigma公司提供；10%過硫酸銨(AP)由濟寧佰一化工有限公司提供；蛋白裂解液，4×蛋白上樣緩沖液由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供；蛋白預(yù)染marker由美國Thermo公司提供；CaSR抗體、β-actin由英國Abcam公司提供；Akt抗體由美國Cell Signaling公司提供；pAkt(s473)抗體、pAkt(T308)抗體由美國Cell Signaling公司提供；FITC標(biāo)記IgG由中杉金橋公司提供；封閉液(5%脫脂奶粉)由內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司提供。梯度單頭PCR儀Bio-RadS1000、real-time PCR儀 Bio-Rad CFX96、電泳儀、Universal Hood Ⅱ型Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)膜儀由美國伯樂公司提供；生物安全柜ESCO class Ⅱ type B2由新加坡藝恩高科技有限公司提供；微量臺式低溫離心機Mircro 17R、離心機由美國Thermo公司提供；紫外分光光度計由島津有限公司提供；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡由日本奧林巴斯公司提供；搖床由海門市其林貝爾公司提供；酶標(biāo)儀由美國MD公司提供。

3.分組及模型制備：(1)正常對照組(L6肌細胞的體外培養(yǎng)、傳代與誘導(dǎo)分化)：L6肌細胞用含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，形成單層貼壁細胞，每隔2天傳代1次。將細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液倒掉，PBS沖洗2次；加入1ml消化液，輕輕晃動，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中2min；取出培養(yǎng)瓶，加入4ml培養(yǎng)基，終止消化，將全部細胞吹下來，使細胞脫離培養(yǎng)瓶底部；將細胞懸液放入15ml離心管中，離心5min；離心后，移除上層廢液，向離心管紅加入培養(yǎng)基，將細胞吹散；沿瓶壁按1∶3比例稀釋加入細胞培養(yǎng)瓶中。當(dāng)L6肌細胞聚合為60%～80%時，更換為含2%胎牛血清及青霉素、鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2天換1次液，6～7天后觀察L6肌細胞的肌管生長情況。(2)模型對照組[腫瘤壞死因子(TNF-α)誘導(dǎo)L6肌細胞產(chǎn)生IR]：將培養(yǎng)板中分化出肌管的肌肉細胞，TNF-α誘導(dǎo)組為6個樣本，TNF-α誘導(dǎo)組每孔加入2ml已配制好的TNF-α溶液(10ng/ml)。(3)花旗澤仁組：根據(jù)本課題組前期最佳藥量配比實驗，得出中藥復(fù)方花旗澤仁的最佳配比[8]。熬制前，將西洋參、澤瀉和薏苡仁三味中藥浸泡12h，加入適量的水煎煮，共煎煮3次，第1次水沸后小火煎煮60min，第2次水沸后繼續(xù)用小火煎煮45min，第3次水沸后小火煎煮30min，合并3次水煎液，過濾，水浴濃縮，含生藥量約為0.54g/ml，4℃保存。含藥血清制備：取正常SD大鼠10只，花旗澤仁組按1ml / 100g灌胃花旗澤仁水煎液，連續(xù)給藥7天。根據(jù)本課題組前期對花旗澤仁主要活性成分在大鼠血漿中藥代動力學(xué)的研究，得出在末次給藥后1h，血藥濃度達到峰值，因此，在末次給藥后1h，按3.5ml/kg腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血，室溫下將血液靜置30min，待凝血堅固，血清析出，4℃ 3000r/min離心15min，再靜置15min后取上清液，同組混勻，56℃滅活30min，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。臨用前將血清用DMEM培養(yǎng)基稀釋成10%的含藥血清溶液。(4)陽性對照組：取羅格列酮4.735mg溶于1ml DMSO中配制成10mmol/L溶液凍存?zhèn)溆?，使用時終濃度為10-5mol/L。(5)細胞骨架考馬斯亮藍染色鑒定：在培養(yǎng)板上將已爬好的玻片用PBS浸洗3次，用2.5%戊二醛固定30min，PBS浸洗3次，每次3min，用1%Triton-100(PBS配制)室溫通透10min，蒸餾水漂洗3次，加入0.2%考馬斯亮藍R-250染色30min，蒸餾水清洗3次，用濾紙吸干水滴，并于顯微鏡下觀察。

4.葡萄糖氧化酶法測培養(yǎng)基中葡萄糖濃度將葡萄糖工作試劑加入100ml ddH2O中，振蕩混勻；96孔板中每孔取8μl培養(yǎng)液，加入含1ml工作試劑的試管中，振蕩混勻，另取標(biāo)準(zhǔn)液8μl，加入含1ml 工作試劑的試管中；37℃水浴20min；每試管取100μl混合液，加入96孔酶標(biāo)板中；酶標(biāo)儀在510nm 處測吸光光度值(A值)；根據(jù)公式計算待測液葡萄糖濃度。待測葡萄糖濃度(mmol/L) =待測液A值/標(biāo)準(zhǔn)液A值×5.5mmol/L。

5.免疫熒光法檢測CaSR在L6細胞上的定位：在培養(yǎng)板上將已爬好的玻片用PBS浸洗；用4%多聚甲醛固定爬片；用0.5% Triton-100(PBS配制)室溫通透20min；PBS浸洗玻片，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min，每張玻片滴加足量稀釋好的一抗放入濕盒中，4℃孵育過夜；第2天，PBST浸洗爬片，滴加稀釋好的二抗，濕盒中孵育1h，PBST浸洗玻片，滴加DAPI避光孵育5min，對細胞進行染核，PBST浸洗，盡量洗去多余DAPI；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

6.實時熒光定量PCR檢測L6細胞上CaSR mRNA的表達：(1)RNA提取的實驗方法：96孔板細胞長至90%以上，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次后，每孔加入Trizol 1ml，搖勻，靜置消化3～5min；將各孔內(nèi)消化好的細胞吸入DEPC水處理過的1.5ml EP管中，加入氯仿0.2ml，輕搖15s；室溫靜置2～3min，4℃，12000r/min離心15min后取上清無色水相(約0.5ml)移到新EP管中，加0.5ml異丙醇，室溫下靜置10min；4℃，12000r/min離心10min，觀察到到管底有白色沉淀即為總RNA，棄去上清，以75%乙醇洗滌EP管后，4℃，7500r/min離心5min；棄上清，將帶有沉淀物的離心管倒扣于濾紙上，干燥10min；用15～20μl DEPC水溶解后，56℃助溶10min，-20℃低溫保存。(2)qRT-PCR實驗：在配套的PCR反應(yīng)管中加入1.0μl dT20、1.0μl 樣本RNA、18.0μl DEPC；將上述溶液混合并按條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板進行PCR擴增，具體試驗操作流程依據(jù)相關(guān)試劑盒操作說明，CaSR引物序列(正向引物序列：5′-TTCTTTGAACCTGGACGACGAGT-3′，反向引物序列：3′-GCGAGGAAGGATTTGTAC-5′)。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10min、95℃ 10s、47℃ 30s，共40個循環(huán)。按照2-△△Ct相對定量法分析目的基因與內(nèi)參基因的相對表達水平。

7.蛋白印跡法檢測L6細胞上CaSR蛋白表達量及Akt活性：(1)CaSR蛋白提取：傾倒培養(yǎng)液，每瓶細胞加入3ml 4℃預(yù)冷的PBS，洗滌細胞3次；洗滌后將培養(yǎng)瓶置于冰上，每瓶細胞加入100μl的細胞裂解液(1ml RIPA+10μl PMSF+10μl蛋白酶抑制劑+10μl磷酸酶抑制劑)，于冰上裂解30min，來回?fù)u動使細胞充分裂解；裂解完后，用移液槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中(整個過程盡量在冰上進行)；4℃ 12000r/min離心15min；將離心后的上清分裝，-80℃保存。(2)免疫印跡實驗：用微量進樣器加入裂解后的細胞樣品，80V電壓開始電泳；電泳結(jié)束后，取出凝膠放入轉(zhuǎn)膜液中，按照膜面積的1.5倍作為電流，恒流轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入裝有適量的5%牛奶封閉液的平皿中，37℃平緩搖動1h；將一抗用TBST稀釋比例為1∶1000，將PVDF膜放入一抗中4℃過夜；將二抗用TBST稀釋比例為1∶5000，將PVDF膜放入二抗中37℃，孵育1h；將ECL化學(xué)發(fā)光試劑滴加到PVDF膜正面上，反應(yīng)2～3min后置于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

結(jié) 果

1.細胞骨架考馬斯亮藍染色鑒定結(jié)果：誘導(dǎo)分化前L6細胞相互交織，以梭形為主，也可見不規(guī)則三角形、多角形等，立體感差，其形狀與成纖維母細胞相似，未見肌性結(jié)構(gòu)出現(xiàn)；顯微鏡下觀察可見，誘導(dǎo)分化后，L6細胞成長梭形，體力感強，細胞體積變小、排練緊密，多個細胞可融合成一條長的肌纖維(圖1A)，考馬斯亮藍染色后長的肌纖維可見多個細胞核(圖1B)，說明此時可用于建立IR模型實驗。

圖1 誘導(dǎo)分化后L6細胞形態(tài)(考馬斯亮藍染色，×100)

2.花旗澤仁對胰島素抵抗L6肌細胞模型葡萄糖消耗量的影響：在L6肌細胞中，與正常對照組比較，模型對照組葡萄糖消耗量明顯下降(P<0.01)，說明胰島素抵抗L6細胞模型被成功建立。與模型對照組比較，花旗澤仁組和陽性對照組葡萄糖消耗量均明顯升高(P<0.05)，詳見表1。

表1 TNF-α對L6細胞葡萄糖消耗量的影響

與正常對照組比較，*P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05；RG.葡萄糖剩余量;CG.葡萄糖消耗量

3.鈣敏感受體免疫熒光檢測結(jié)果：在L6肌細胞正常對照組、模型對照組和花旗澤仁組中均發(fā)現(xiàn)CaSR的表達，與正常對照組比較，CaSR在模型對照組中的分布較稀疏；與模型對照組比較，花旗澤仁組CaSR的分布較密集，詳見圖2。

圖2 各組鈣敏感受體分布圖(免疫熒光染色，×50)A.正常對照組細胞核染色；B.正常對照組受體染色；C.模型對照組細胞核染色； D.模型對照組受體染色； E.花旗澤仁組細胞核染色；F.花旗澤仁組受體染色

4.花旗澤仁對胰島素抵抗L6肌細胞中CaSR mRNA及CaSR蛋白表達水平的影響：在L6肌細胞中，與正常對照組比較，模型對照組CaSR mRNA表達水平下調(diào)(P=0.000)；與模型對照組比較，花旗澤仁組和陽性對照組CaSR mRNA表達水平顯著上調(diào)(P<0.01，表2、圖3)。CaSR蛋白表達的影響：與正常對照組比較，模型對照組中L6肌細胞CaSR蛋白表達顯著下降(P=0.000)；與模型對照組比較，花旗澤仁組、陽性對照組中L6肌細胞CaSR蛋白表達水平明顯升高(P均為0.000)，詳見表2、圖4。

表2 花旗澤仁對胰島素抵抗L6肌細胞中CaSR mRNA及CaSR蛋白表達水平的影響

與正常對照組比較,*P=0.000；與模型對照組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P=0.000

圖3 花旗澤仁對L6肌細胞中CaSR mRNA表達水平的影響與正常對照組比較，*P=0.000;與模型對照組比較，#P<0.01

圖4 花旗澤仁對L6肌細胞CaSR 蛋白表達水平的影響A.Western blot法檢測結(jié)果；B.蛋白灰度值。與正常對照組比較，*P=0.000;與模型對照組比較，#P<0.05,##P=0.000

5.花旗澤仁對胰島素抵抗L6肌細胞蛋白激酶B(AKT)活性的影響：與正常對照組比較，模型對照組L6肌細胞中磷酸化AKT(Thr308和Ser473)蛋白含量顯著下降(P均為0.000)；與模型對照組比較，花旗澤仁組L6肌細胞磷酸化AKT(Thr308 和Ser473)蛋白表達水平明顯升高(P均為0.000)；陽性對照組L6肌細胞磷酸化AKT(Thr308)蛋白表達水平明顯升高(P=0.000)，AKT(Ser473)蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義,詳見表3、圖5。

6.采用免疫印跡法觀察CaSR激動劑對IR細胞模型AKT活性的影響：如表4、圖6所示，與正常對照組比較，模型對照組L6肌細胞中磷酸化AKT(Thr308和Ser473)蛋白含量顯著下降(P<0.01)；與模型對照組比較，激動劑對照組L6肌細胞磷酸化AKT(Thr308 和Ser473)蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)。

表3 花旗澤仁對L6肌細胞中Thr308和Ser473蛋白磷酸化水平的影響

與正常對照組比較,*P=0.000；與模型對照組比較,#P<0.05,##P=0.000

圖5 花旗澤仁對L6肌細胞磷酸化Akt蛋白表達水平的影響A.Western blot法檢測結(jié)果；B.蛋白灰度值。與正常對照組比較，*P=0.000;與模型對照組比較，#P<0.005，##P=0.000

表4 鈣敏感受體激動劑對L6肌細胞中Thr308和Ser473蛋白的影響

與正常對照組比較,*P<0.01；與模型對照組比較,#P<0.01

圖6 花旗澤仁及CaSR激動劑對L6肌細胞磷酸化Akt蛋白表達水平的影響A.Western blot法檢測結(jié)果；B.蛋白灰度值。與正常對照組比較，*P<0.01;與模型對照組比較，#P<0.01

討 論

隨著人們生活水平的日益提高，糖尿病，特別是2型糖尿病胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的發(fā)生率呈現(xiàn)迅猛增長趨勢[2]。IR貫穿2型糖尿病主要發(fā)病過程。目前普遍認(rèn)為，肝臟、脂肪、骨骼肌及胰腺組織是發(fā)生IR的重要靶組織[9]。本課題組前期研究已顯示花旗澤仁改善IR大鼠肝臟、脂肪、骨骼肌及胰腺組織的相關(guān)機制，而本實驗采用L6肌細胞為實驗研究對象，從細胞水平上進一步探究花旗澤仁改善IR的分子機制。

骨骼肌是全身利用葡萄糖最重要的組織之一，胰島素刺激的葡萄糖利用中約有80%由骨骼肌攝取[10]。在肌細胞內(nèi)，胰島素抗性降低了葡萄糖的吸收。當(dāng)發(fā)展成全身IR時，骨骼肌對葡萄糖的攝取能力下降可能最終導(dǎo)致 2 型糖尿病的發(fā)生[11]。骨骼肌細胞攝取葡萄糖主要通過胞內(nèi)區(qū)室GLUT4與細胞質(zhì)膜和橫小管來完成[12]。本實驗采用的大鼠L6肌細胞能反映出關(guān)于IR的生理病理狀態(tài)，是研究IR機制很好的體外細胞模型。因此，建立骨骼肌細胞的IR模型對研究IR機制及IR的防治有著重要意義。

鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)是G蛋白偶聯(lián)受體的C家族成員，是一種整合膜蛋白[13]。本研究中，采用免疫熒光技術(shù)檢測到在L6肌細胞中有CaSR存在，并且可觀察到模型對照組L6肌細胞中的CaSR數(shù)量明顯低于正常對照組，通過qRT-PCR實驗檢測到CaSR mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)發(fā)生IR時，在L6肌細胞中CaSR mRNA表達量成下降趨勢。并通過免疫蛋白印跡(Western blot)法實驗，觀察到L6肌細胞中模型對照組中CaSR蛋白表達水平亦顯著下調(diào)。

蛋白激酶B(AKT)，是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在多種細胞過程中起著關(guān)鍵作用。AKT 通過結(jié)合并調(diào)節(jié)許多下游效應(yīng)物(例如核因子-κB，Bcl-2家族蛋白)調(diào)節(jié)細胞存活和代謝[14]。Akt2是胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運所必需的。糖原合酶激酶3(GSK3)可被AKT磷酸化后抑制，導(dǎo)致糖原合成增加。GSK3也參與Wnt信號級聯(lián)，AKT可能也涉及Wnt途徑[15，16]。

胰島素與受體結(jié)合后，主要通過促進葡萄糖利用、糖原合成、抑制糖異生而實現(xiàn)其降低血糖的作用[17]。而PI3K/AKT通路是胰島素實現(xiàn)其上述作用的主要途徑，激活PI3K信號通路，可激活綁定在磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸上的絲氨酸或蘇氨酸(Ser473、Thr308)兩個主要磷酸化位點，從而激活A(yù)KT使其發(fā)揮作用[18，19]。本實驗采用Western blot法檢測L6肌細胞中Thr308、Ser473蛋白，同時采用Western blot法檢測CaSR激動劑(GdCl3)對AKT蛋白活性的影響，發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，模型對照組蛋白激酶B(AKT)磷酸化(Thr308、Ser473)蛋白表達明顯降低，與模型對照組比較，GdCl3對照組L6肌細胞磷酸化AKT(Thr308 和Ser473)蛋白表達水平明顯升高。實驗結(jié)果顯示，L6肌細胞發(fā)生IR時，磷酸化AKT蛋白含量明顯下降，AKT活性被抑制，并且CaSR激動劑(GdCl3)可上調(diào)AKT活性，提示CaSR可能參與PI3K/AKT信號通路。

花旗澤仁改善IR中藥復(fù)方花旗澤仁為臨床治療2型糖尿病IR的有效經(jīng)驗方，本方基于中醫(yī)藥整體觀念和辨證論治的理論，從2型糖尿病IR脾虛濕盛，濕熱內(nèi)蘊的病理特點出發(fā)，以補氣養(yǎng)陰、清火生津之功的西洋參為君藥，滲濕健脾的薏苡仁為臣藥，利水滲濕、泄熱之澤瀉為佐藥，配伍組成花旗澤仁中藥復(fù)方，共奏補氣、健脾、生津、清熱、利濕之功[20]。

本課題組前期通過qRT-PCR與Western blot法技術(shù)對比檢測2型糖尿病IR大鼠、正常大鼠以及花旗澤仁給藥大鼠的肝臟、脂肪、肌肉及胰腺組織中的CaSR mRNA、蛋白表達和AKT(Thr308 和Ser473)蛋白表達水平的差異，結(jié)果表明花旗澤仁具有降血糖、升高胰島素敏感度、上調(diào)CaSR mRNA表達、CaSR蛋白表達及AKT(Thr308和Ser473)蛋白表達的作用。

綜上所述，本研究與模型對照組比較，花旗澤仁組L6肌細胞中CaSR mRNA、蛋白及AKT磷酸化(Thr308、Ser473)蛋白表達水平顯著上升，本研究結(jié)果表明，花旗澤仁可能通過調(diào)節(jié)CaSR基因及蛋白的表達，激活A(yù)KT的活性，進而調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而改善胰島素抵抗。