董迎

(天津北辰醫(yī)院內分泌科，天津 300400)

老年2型糖尿病作為一種臨床十分常見的進展性的內分泌代謝疾病，與人們的生活方式密切相關，對患者的身體健康造成嚴重的影響〔1〕。2型糖尿病患者體內會有胰島素表達的缺陷，目前臨床上治療2型糖尿病多采用增加外源性胰島素，但長期使用效果往往不太理想〔2,3〕。瘦素(LP)是由脂肪組織分泌的一種蛋白質，能夠對機體的血糖水平進行調控，但是關于其對胰島素相關指標影響的研究還較少〔4〕。本文研究使用不同劑量的外源性LP對糖尿病模型大鼠進行干預，旨在探究其對血糖及胰島素相關指標的影響。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：50只健康SD雄性大鼠，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，18～20月齡，平均(3.8±1.5)月齡，體重300～350 g，平均體重(220±7.9)g。大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時間為1 w。本實驗獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

主要試劑、儀器：兔抗人LP抗體、LP受體(Ob-R)抗體(BD公司)；大鼠抗小鼠空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)抗體(Sigma公司)；兔抗小鼠空腹胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(HOMA-IR)抗體(Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)抗體(Hyclone公司)；兔抗大鼠血清趨化素(Chemerin)抗體(BD公司)。

1.2方法

1.2.1建模及處理 隨機選取10只大鼠作為正常組，使用普通飼料對正常組大鼠進行喂食。使用高糖高脂飼料喂養(yǎng)剩余大鼠，喂養(yǎng)1個月后，使用鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg對大鼠進行腹腔內注射，之后再次使用高糖高脂飼料喂養(yǎng)1個月。取大鼠尾部靜脈血進行血糖測定，連續(xù)1 w時間空腹血糖>16.7 mmol/L，且有飲食量增加、生長緩慢及身體消瘦等臨床表現的大鼠為糖尿病模型建立成功，最終建模成功38只，將38只糖尿病模型大鼠隨機分為模型組、高劑量組各9只及低、中劑量組各10只。對4組大鼠進行麻醉處理后將其分別放置于腦立體定位儀上，將大鼠的牙齒扣于齒桿上并將鼻夾扭緊，在大鼠雙耳的外耳道中插入耳桿，并且使兩側的耳桿刻度保持一致。對大鼠的軀體進行適度調節(jié)，使身體與頭部保持同一水平位置，并進行固定。對大鼠的頭部皮膚進行消毒后剪開，使用手術刀片將骨膜剝離，并使用過氧化氫進行灼燒，使大鼠冠狀縫與矢狀縫的交點完全顯露出，并進行標記。使用電動顱骨鉆在此標記點部位做一直徑為0.5 mm的小孔，將裝有注射液的微量進樣器自小孔部位插入至4.5 mm深時停止,對大鼠的呼吸狀況進行觀察，若無異常表現，則將注射液緩慢注射，正常組、模型組大鼠注射生理鹽水8 μl/kg，低劑量組大鼠注射LP 2 μl/kg，各劑量組按照低∶中∶高=1∶2∶4比例注射瘦素。注射結束后將注射器緩慢取出并對傷口進行抗感染處理，待所有大鼠清醒后進行單獨飼養(yǎng)。見圖1。

A：使用腦立體定位儀將大鼠頭部固定；B：使用微量進樣器將LP注入大鼠側腦室部位圖1 側腦室腦立體定位及大鼠側腦室注射LP

1.2.2標本采集 對所有大鼠禁食4 h，之后分別取4組大鼠尾部靜脈血5 ml,在抗凝管中保存，之后使用轉速為3 000 r/min的離心機，離心處理20 min，放入潔凈的EP試管中，分離上層血清，在-80℃環(huán)境中保存，待用。

1.2.3Western印跡檢測LP、Ob-R水平 待測標本進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液，靜置15 min；在100 V的環(huán)境中電泳10 min后，將電轉膜放置在37℃的封閉環(huán)境中的搖床上，然后加入10%的牛奶，靜置1.5 h后加入TBST稀釋，按(1∶1 000)稀釋，在5℃的環(huán)境下，經過孵育后過夜保存；第2天使用TBST緩沖液清洗，在室溫的環(huán)境中與二抗結合，孵育1 h后再次用TBST緩沖液清洗，最后將其浸泡在底物溶液中進行顯色，采用BCA蛋白定量試劑盒，分析其灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值=目的蛋白相對表達量，達到檢測LP、Ob-R水平的目的。

1.2.4免疫透射比濁法檢測FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR水平 將待測標本放入特定蛋白分析儀中，利用比濁計測定光的密度值，分析FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR的水平，并進行組間比較。

1.2.5化學發(fā)光法檢測TG、TC水平 采用化學發(fā)光法對4組大鼠的TG、TC水平進行檢測，待測標本加入化學發(fā)光物質，與催化劑發(fā)生催化反應，與氧化劑發(fā)生氧化反應，形成處于激發(fā)狀態(tài)的中間體，當中間體達到穩(wěn)定時，會發(fā)射出光子，嚴格按照化學發(fā)光分析儀操作步驟，利用發(fā)光信號測量儀測量光子數值，對比分析TG、TC水平。

1.2.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清Chemerin水平 提取已采集的血清樣本，將待測的標本和酶標物嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟測定Chemerin的水平。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行重復測量數據方差分析、F檢驗、獨立t檢驗。

2 結 果

2.1各組LP、Ob-R水平對比 正常組LP水平顯著低于模型組和各劑量組，Ob-R顯著高于模型組和各劑量組(P<0.05)。模型組LP水平顯著高于各劑量組，Ob-R顯著低于各劑量組(P<0.05)。高劑量組LP水平顯著低于低、中劑量組，Ob-R顯著高于低、中劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組LP、Ob-R水平對比

與正常組相比:1)P<0.05；與模型組相比:2)P<0.05；與低劑量組相比:3)P<0.05，與中劑量組相比:4)P<0.05；下表同

2.2各組血清FBG、HbA1c水平對比 模型組FBG、HbA1c水平顯著高于正常組(P<0.05)，各劑量組FBG、HbA1c水平均顯著低于模型組，且高劑量組FBG、HbA1c水平顯著低于低、中劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清FBG、HbA1c水平對比

2.3各組血清FINS、HOMA-IR水平對比 模型組FINS、HOMA-IR水平顯著高于正常組(P<0.05)，各劑量組FINS、HOMA-IR水平均顯著低于模型組，且高劑量組FINS、HOMA-IR水平顯著低于低、中劑量組(P<0.05)。見表3。

表3 各血清FINS、HOMA-IR水平對比

2.4各組血清TG、TC、Chemerin水平對比 模型組TG、TC、Chemerin水平顯著高于正常組(P<0.05)，各劑量組TG、TC、Chemerin水平均顯著低于模型組，且高劑量組TG、TC、Chemerin水平顯著低于低、中劑量組(P<0.05)。見表4。

表4 各組血清TG、TC、Chemerin水平對比

3 討 論

2型糖尿病作為一種臨床十分常見的進展性的內分泌代謝疾病，與人們的生活方式密切相關，對患者的身體健康造成嚴重的影響〔5,6〕。2型糖尿病癥狀的發(fā)生與許多因素有著直接或間接的關系，例如遺傳因素、社會發(fā)展因素、生活習慣及環(huán)境因素等〔7〕，近些年來，隨著社會的不斷發(fā)展，人們生活水平不斷提升，飲食結構也隨之改變，而不良飲食習慣與生活習慣導致2型糖尿病發(fā)病率一直居高不下，在世界范圍內，2型糖尿病癥狀的發(fā)病率和死亡率一直呈現不斷上升趨勢〔8〕。2型糖尿病患者的主要臨床表現為“三多一少”，即多尿、多飲、多食和體重下降，也有些患者會出現乏力、視力下降等癥狀，而患者身體長期處于高血糖狀態(tài)，很有可能會導致慢性神經損害和功能障礙癥狀〔9〕。此外，2型糖尿病癥狀還伴有多種并發(fā)癥，是除心血管疾病和惡性腫瘤之后的另一種嚴重威脅人身體健康和生命安全的非傳染性疾病〔10，11〕。

Lp是一種能夠對機體的攝食及能量平衡等進行調控的物質，還能夠調節(jié)機體的內分泌免疫機制〔12〕，有學者通過實驗研究表明，低劑量的外源性Lp能夠降低糖尿病模型大鼠的血糖水平，但是，關于高劑量的外源性LP對糖尿病模型大鼠血糖水平影響的研究還相對較少〔13〕。本文研究中使用不同劑量LP對糖尿病模型大鼠進行干預，結果顯示，在較高劑量外源性LP的干預下，糖尿病模型大鼠的LP、Ob-R及FBG水平受到明顯調控而趨近于正常水平，說明較高劑量的外源性LP能夠調節(jié)糖尿病大鼠的血糖水平及LP水平。

TG和TC在2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中起到重要作用〔14〕，有相關研究表明，TG和TC表達水平較高患2型糖尿病的概率會更高，因為TG、TC的高表達會導致內皮受損及氧化應激反應的發(fā)生，從而引起炎癥介質的高表達，致使血糖水平升高〔15〕。TG水平升高在2型糖尿病癥狀的形成過程中發(fā)揮著重要的作用，而且高水平的TG還能夠引起胰腺炎，使胰島素分泌障礙，導致1型糖尿病的發(fā)生，甚至還會引起不可逆性胰腺炎的發(fā)生，形成永久性的1型糖尿病。雖然可以通過藥物將TG的高表達控制在正常水平范圍內，但是仍會表達為高血糖〔16〕。有相關研究表明，脂肪組織是人體重要的內分泌器官，能夠分泌出與機體能量代謝相關的激素和細胞因子，而且這些因子在2型糖尿病的發(fā)病機制中都具有重要的作用，并且越來越受到人們的重視〔17〕。Chemerin是近些年發(fā)現的脂肪細胞因子新成員，也是一種脂肪細胞分泌出來具有趨化作用的膜結合蛋白，在人體的多種組織中廣泛表達，包括腎上腺、肝臟、胰腺、卵巢、胎盤、皮膚、肺等，主要表達于肝臟和肺〔18〕。Chemerin能夠對脂肪細胞的分化、代謝起到調節(jié)作用，還會促進脂肪分解效應的產生，增強胰島素刺激引起的葡萄糖攝取〔19〕。本文研究結果顯示，使用較高劑量的外源性LP對糖尿病模型大鼠進行干預，能夠有效控制糖尿病模型大鼠血清TG、TC、Chemerin的表達水平，從而能夠緩解其內皮受損程度及氧化應激反應，還能增強脂肪分解效應。FINS、HOMA-IR是兩種常見的胰島素相關指標，常用于糖尿病癥狀的臨床檢測〔20〕。對FINS、HOMA-IR進行檢測，能夠較為直觀地反映出機體內胰島素水平。本文研究結果顯示，使用較高劑量的外源性LP對糖尿病模型大鼠進行干預，能夠明顯抑制模型大鼠FINS、HOMA-IR水平，說明較高劑量的外源性LP能夠對機體胰島素指標進行調控。

綜上所述，經側腦室注射外源性的LP能夠對糖尿病模型大鼠的血糖、胰島素相關指標進行調控，且較大劑量的外源性LP干預效果更加明顯，為糖尿病癥狀的臨床治療提供了一定的參考。