祁英杰 朱竹君 張歡妍 于明

(江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 常州 213200；2檢驗(yàn)科；3江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

微小核糖核酸(miRNA)由18～25個(gè)核苷酸組成，內(nèi)源性穩(wěn)定，可直接降解mRNA及轉(zhuǎn)錄后阻斷靶基因的翻譯，通過這些過程，miRNAs調(diào)節(jié)了各種生理功能，包括阿爾茨海默病(AD)的發(fā)生和發(fā)展〔1,2〕。然而，關(guān)于miRNA在AD中的作用知之甚少。miR-107雖在AD中具有重要的調(diào)控功能，但是其作用機(jī)制尚未完全清楚。膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的溶質(zhì)載體(SLC)25位于線粒體內(nèi)膜上，因此被稱為線粒體載體〔3，4〕。SLC25是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，包含6個(gè)α-螺旋跨膜區(qū)域〔5〕。SLC25成員蛋白由核基因編碼并在胞質(zhì)溶膠中合成，新合成的蛋白質(zhì)隨后易位到線粒體的內(nèi)膜中運(yùn)輸各種底物，如細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)之間的代謝物(核苷酸和輔因子)，SLC25A38屬于SLC25家族〔6〕。本研究擬探討miR-107-3p與SLC25A38在AD中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12購自中國科學(xué)研究院細(xì)胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基購自武漢純度生物公司；胎牛血清購自江蘇寶萊生物公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑購自河南華美生物工程有限公司；胰蛋白酶購自美國Sellect公司；LipofectamineTM2000購自上海陽光生物工程有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液購自上海貝博生物科技公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海碧云天研究所；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自南寧諾唯贊生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)及AD模型的建立 將PC12細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)、傳代，標(biāo)記為對照組。參照喬娜娜等〔7〕的方法建立AD細(xì)胞模型，標(biāo)記為模型組。

1.3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 調(diào)整模型組細(xì)胞至105個(gè)/ml，按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體試劑說明書要求操作，取4倍DNA或質(zhì)粒量的脂質(zhì)體進(jìn)行miR-NC、miR-107-3p mimics、si-NC、si-SLC25A38、miR-107-3p+pcDNA、miR-107-3p+pcDNA-SLC25A38的轉(zhuǎn)染，將其轉(zhuǎn)染至模型組細(xì)胞中，先轉(zhuǎn)染6 h，再更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染的效率，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后依次標(biāo)記為模型+miR-NC組、模型+miR-107-3p組、模型+si-NC組、模型+si-SLC25A38組、模型+miR-107-3p+pcDNA組、模型+miR-107-3p+pcDNA-SLC25A38組，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4qRT-PCR法檢測細(xì)胞中miR-107-3p、SLC25A38的表達(dá) 收集細(xì)胞，用Trizol液提取總RNA，然后盡快用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成cDNA。最后用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行miR-107-3p、SLC25A38的檢測。以U6、β-actin為內(nèi)參，用2-△△Ct計(jì)算miR-107-3p、SLC25A38的表達(dá)。miR-107-3p上游引物ATGATGAGCAGCATTGTACAGG，下游引物GCAGGGTCCGAGGTATTC；U6 上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT；SLC25A38上游引物GTCGGAGACGCGGTGGAAAC，下游引物GCCAACATCCCAACACGTGTA；β-actin上游引物GACCTCTATGCCAACACAGT，下游引物AGTACTTGCGCTCAGGAGGA。

1.5Western印跡檢測細(xì)胞中SLC25A38的蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，加入裂解液使細(xì)胞充分裂解，提取總蛋白并定量。用十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液稀釋后進(jìn)行沸水浴變性，取其上清液進(jìn)行蛋白電泳上樣。電泳時(shí)先穩(wěn)壓電泳約50 min，再進(jìn)行穩(wěn)流電泳約1 h，結(jié)束后，小心取出蛋白膠，避免膠破損。將膠上的蛋白用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在轉(zhuǎn)膜過程中必須保證整個(gè)操作環(huán)境的低溫狀態(tài)(0～4℃)。轉(zhuǎn)膜后，將膜用5%的脫脂奶粉封閉處理2 h，結(jié)束后再將膜小心轉(zhuǎn)移至稀釋好的Ⅰ抗溶液中，4℃孵育過夜。取出膜浸入稀釋好的Ⅱ抗溶液中，37℃孵育 2 h。結(jié)束后，將膜用ECL液進(jìn)行顯影、曝光，所得圖像用Image J分析條帶的灰度值，用目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)。

1.6MTT法檢測細(xì)胞存活率 收集細(xì)胞，調(diào)整至5×105個(gè)/ml，取100 μl接種至96孔板，按照MTT試劑使用要求操作，每孔加MTT溶液、二甲基亞砜(DMSO)，避光輕輕震蕩使結(jié)晶發(fā)生融解。最后在酶標(biāo)儀上設(shè)置490 nm波長，檢測細(xì)胞的吸光度(A)。細(xì)胞的存活率=A490樣品/A490對照×100%。

1.7Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，用適量結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，按Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒要求，依次加入Annexin V-/FITC、PI均進(jìn)行避光反應(yīng)，結(jié)束后立即上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測分析。細(xì)胞凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的熒光活性 首先構(gòu)建突變型(WT)和野生型(MUT)SLC25A38基因〔SLC25A38 3′非翻譯區(qū)(UTR)MUT和SLC25A38 3′ UTR WT〕將其克隆至載體psiCHECK2，構(gòu)建psiCHECK2-SLC25A38 WT和psiCHECK2-SLC25A38 MUT熒光載體質(zhì)粒。再將其通過脂質(zhì)體法分別與miR-NC、miR-107-3p共轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞。按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書操作，進(jìn)行細(xì)胞裂解、加入底物，結(jié)果以螢火蟲熒光素酶活性為內(nèi)參，海腎熒光素酶的熒光強(qiáng)度與螢火蟲熒光強(qiáng)度的比值反映細(xì)胞的熒光活性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-107-3p、SLC25A38在AD細(xì)胞模型中的表達(dá) 與對照組比較，模型組miR-107-3p表達(dá)顯著降低，SLC25A38 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 對照組和模型組SLC25A38蛋白表達(dá)

表1 miR-107-3p和SLC25A38在AD細(xì)胞模型中的表達(dá)

2.2過表達(dá)miR-107-3p對AD細(xì)胞存活率的影響 與對照組比較，模型組miR-107-3p表達(dá)顯著降低，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)；與模型+miR-NC組比較，模型+miR-107-3p組，miR-107-3p表達(dá)及細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 miR-107-3p過表達(dá)對AD細(xì)胞存活率及細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較:1)P<0.05；與模型+miR-NC組比較:2)P<0.05

2.3過表達(dá)miR-107-3p對AD細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高；與模型+miR-NC組比較，模型+miR-107-3p組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表2，圖2。

圖2 細(xì)胞凋亡流式圖

2.4miR-107-3p靶向調(diào)控SLC25A38的表達(dá) 運(yùn)用starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-107-3p與SLC25A38的序列結(jié)合位點(diǎn)(圖3)；與miR-NC組比較，miR-107-3p組WT-SLC25A38細(xì)胞中熒光活性顯著降低，MUT-SLC25A38細(xì)胞中熒光活性不受影響(表3)，與模型+miR-NC組(0.39±0.04)比較，模型+miR-107-3p組，細(xì)胞中SLC25A38表達(dá)(0.18±0.03)顯著降低，與模型+anti-miR-NC組(0.37±0.03)比較，模型+anti-miR-107-3p組，細(xì)胞中SLC25A38表達(dá)(0.82±0.07)顯著升高(P<0.05)。見圖4。

圖3 SLC25A38的3′UTR中含有與miR-107-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：模型+miR-NC組,模型+miR-107-3p組,模型+anti-miR-NC組,模型+anti-miR-107-3p組圖4 各組SLC25A38蛋白表達(dá)

2.5抑制SLC25A38表達(dá)對AD細(xì)胞存活率和凋亡的影響 與模型+si-NC組比較，模型+si-SLC25A38組細(xì)胞中SLC25A38蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5、表4。

圖5 模型+si-NC組及模型+si-SLC25A38組SLC25A38蛋白表達(dá)

表4 抑制SLC25A38表達(dá)對AD細(xì)胞存活率和凋亡的影響

2.6SLC25A38過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-107-3p過表達(dá)對AD細(xì)胞存活率和凋亡率的作用 模型+miR-107-3p+pcDNA-SLC25A38組與模型組+miR-107-3p+pcDNA組比較，細(xì)胞中SLC25A38蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖6，表5。

1：模型+miR-107-3p+pcDNA組；2:模型miR-107-3p+pcDNA-SLC25A38組圖6 Western印跡檢測SLC25A38蛋白表達(dá)

表5 SLC25A38過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-107-3p過表達(dá)對AD細(xì)胞存活率和凋亡率的作用

3 討 論

隨著AD的患病率增加，尋找確定的，易于獲取的診斷生物標(biāo)志物變得越來越重要。參與蛋白質(zhì)合成的表觀遺傳調(diào)控的miRNA是一種生物標(biāo)記，與許多疾病狀態(tài)地變化相關(guān)。與AD相關(guān)的miRNA有miR-107、miR-125b、miR-146a、miR-181c、miR-29b和miR-342，其中作用最顯著的為miR-107〔8〕。阮杰等〔9〕、段冉冉等〔10〕在研究中均報(bào)道，miR-107與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Wang等〔11〕使用miRNA表達(dá)微陣列對肯塔基州AD中心腦庫中提取的人腦組織中提取的RNA進(jìn)行了近乎最佳的臨床病理學(xué)相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，在AD相關(guān)的miRNA表達(dá)變化中，miR-107是特殊的，因?yàn)榧词乖诓±碜钤珉A段的患者中miR-107水平也顯著降低，與神經(jīng)病理學(xué)交叉比較的原位雜交證明AD病理學(xué)涉及的特定大腦皮質(zhì)層表現(xiàn)出神經(jīng)元中miR-107表達(dá)減少，另外，計(jì)算分析預(yù)測β位點(diǎn)淀粉樣蛋白前體蛋白切割酶(BACE)1 mRNA的3′-UTR被miR-107靶向增殖，在miRNA微陣列上分析的相同RNA材料，使用Affymetrix外顯子陣列微陣列在非癡呆，輕度認(rèn)知障礙(MCI)和AD患者上進(jìn)行mRNA表達(dá)譜分析顯示，隨著miR-107水平在AD進(jìn)展中降低，BACE1 mRNA水平趨于增加，用預(yù)測的miR-107結(jié)合位點(diǎn)的子集進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)報(bào)道分子測定表明，在BACE1 mRNA的3′-UTR中存在至少1種生理miR-107 miRNA識(shí)別序列，表明miR-107可能通過調(diào)節(jié)BACE1參與加速疾病進(jìn)展。王雪銀等〔12〕通過構(gòu)建上調(diào)miR-107的AD大鼠發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-107后大鼠腦組織中記憶相關(guān)蛋白NMDA受體2B和谷氨酸受體1的表達(dá)量均明顯的升高，空間依賴的學(xué)習(xí)記憶力得到明顯的改善。Hu等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，在Tg19959小鼠模型中miR-107低表達(dá)，而SYK高表達(dá)，熒光素酶測定證實(shí)了miR-107和SYK中的靶向關(guān)系，且核因子(NF)-κB信號(hào)通路在體外被激活，另外通過DAPI染色驗(yàn)證抑制SYK或NF-κB信號(hào)通路可減少Tg19959小鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，揭示了miR-107可通過抑制NF-κB信號(hào)通路和SYK改善空間記憶和抑制細(xì)胞凋亡。本研究是國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)miR-107-3p在AD中與SLC25A38的作用機(jī)制，為miR-107-3p用于AD的靶向治療提供更充分的理論依據(jù)。

研究證實(shí)，SLC25A38的表達(dá)水平在AD患者中明顯升高，并且在原代大鼠和小鼠神經(jīng)元及人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中β-淀粉樣蛋白42可上調(diào)SLC25A38水平增加胱天蛋白酶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，SLC25A38的小干擾RNA降低了β-淀粉樣蛋白42誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且敲除SLC25A38在動(dòng)物AD模型中可明顯改善神經(jīng)損傷和認(rèn)知能力〔14〕。Zheng等〔15〕發(fā)現(xiàn)，在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中SLC25A38過度表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞內(nèi)的血紅素表達(dá)水平升高，ROS過量產(chǎn)生，線粒體膜電位喪失。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SLC25A38可逆轉(zhuǎn)miR-107-3p對AD細(xì)胞存活率和凋亡率的作用。

綜上，miR-107-3p可促進(jìn)AD細(xì)胞的存活，抑制凋亡，其機(jī)制可能與靶向SLC25A38有關(guān)，為AD的治療提供新方向。