李燕華 韋俊杰 周禮圓 范秉林 陳志 韋旋 歐陽列鋒

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 530021)

在腦缺血早期，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9的表達(dá)及其活性會(huì)受到血流動(dòng)力學(xué)改變、損傷、炎癥及氧化應(yīng)激等因素影響而升高〔1〕，升高后MMP-9與腦缺血和腦水腫的發(fā)展呈平行關(guān)系〔2〕。水通道蛋白(AQP)4在星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)最為豐富,在腦組織水的運(yùn)輸和調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用〔3〕，AQP4表達(dá)上調(diào)可能是腦水腫形成的一個(gè)重要致病環(huán)節(jié)。MMP-9的過度表達(dá)和激活在心血管疾病的病理生理過程中起重要作用〔4〕，但其在缺血性腦血管病繼發(fā)性腦水腫中的機(jī)制尚不清楚。本研究旨在觀察抑制MMP-9表達(dá)及氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4表達(dá)的變化。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 2 d 新生SD大鼠(廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。小牛血清、DMEM(Hyclone公司)，兔抗AQP4抗體(Abcam公司)，兔抗MMP-9抗體購(gòu)自Proteintech公司，相應(yīng)的二抗和鼠抗GAPDH抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。MMP-9、AQP4和β-actin的RT-PCR引物合成由上海吉?jiǎng)P生物公司提供。

1.2星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 取2 d新生SD大鼠，75%酒精浸泡消毒后，斷頭取皮層組織，入冰冷D-hanks液中仔細(xì)剝除軟腦膜和皮層血管，反復(fù)輕柔吹打制成細(xì)胞懸液，過濾，收集濾液，然后轉(zhuǎn)入70 ml培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)1 w左右進(jìn)行缺糖缺氧處理。取傳代2次的細(xì)胞進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白神經(jīng)腦質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，證實(shí)為星形膠質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)均使用培養(yǎng)第2代的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.3缺血細(xì)胞模型的制備 將細(xì)胞培養(yǎng)板置于特制有機(jī)玻璃通氣槽內(nèi)，加入無糖培養(yǎng)基，持續(xù)通入不含氧的混合氣體(5%CO2+95%N2)來模擬缺糖缺氧環(huán)境，密封，置于37℃溫箱內(nèi)，并調(diào)節(jié)氣流量的流速，要求氣體流速為5 L/min。經(jīng)缺糖缺氧處理至少12 h后，可轉(zhuǎn)移到正常氧濃度和含糖培養(yǎng)基條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h，模擬細(xì)胞缺血損傷的病理生理學(xué)過程。

1.4慢病毒轉(zhuǎn)染 星形膠質(zhì)細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)分組按照上海吉?jiǎng)P生物公司的慢病毒手冊(cè)，按照不同的復(fù)感染指數(shù)(MOI)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)第2天時(shí)，進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，24 h后，更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h 后，通過倒置熒光顯微鏡來觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分為3組，正常組不制成缺血細(xì)胞模型；陰性對(duì)照組：加入陰性對(duì)照siRNA后，再制成缺血細(xì)胞模型；MMP-9抑制組：經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，再制成缺血細(xì)胞模型。

1.5四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞活力 分別取各組細(xì)胞，每組孔數(shù)為6孔，每孔加入15 μl/ml MTT(5 mg/ml)置于37℃ 5 % CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，吸出孔內(nèi)液體，然后加150 μl二甲基亞砜至MTT反應(yīng)結(jié)晶產(chǎn)物完全溶解，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm，檢測(cè)每孔光密度(OD)值。

1.6免疫印跡法檢測(cè)AQP4蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，細(xì)胞加入組織裂解液后離心提取總蛋白，采用Bradford法蛋白定量，在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠每個(gè)點(diǎn)樣孔中加入5 μg蛋白進(jìn)行電泳，待確定片段大小后，免疫印跡轉(zhuǎn)染到聚偏二氟乙烯膜，加封閉液室溫封閉1 h，繼之用目的蛋白AQP4和GAPDH的一抗4℃過夜孵育，再用結(jié)合辣根過氧化物酶的二抗孵育。化學(xué)發(fā)光法顯現(xiàn)蛋白帶并照相，用 Lab4.3對(duì)條帶進(jìn)行密度分析。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)MMP-9和AQP4 mRNA表達(dá) 直接提取細(xì)胞RNA，將適量RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)以往研究〔5〕方法，MMP-9上游引物序列：5′-GTCCAGACCAAGGGTACAG-3′，下游引物序列：5′-TTAGAGCCACGACCATACAG-3′，擴(kuò)增片段為：181 bp；AQP4上游引物序列：5′-GAGGCGGTGGGGTAAGTGT-3′，下游引物序列：5′-TCCAAAGCAGAGGGAGATG-3′，擴(kuò)增片段為214 bp；β-actin上游引物序列：5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物序列：5′-CTCAGCACCAGCATCACC-3′，擴(kuò)增片段114 bp。用SYBR green熒光定量檢測(cè)法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪和慢病毒轉(zhuǎn)染MMP-9處理后，正常組OD值為 0.25±0.01，陰性對(duì)照組為 0.16±0.001，MMP-9抑制組為0.15±0.003，MMP-9抑制組和陰性對(duì)照組OD值明顯低于正常組(P<0.01)；MMP-9抑制組與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組MMP-9表達(dá)水平比較 陰性對(duì)照組和MMP-9抑制組轉(zhuǎn)染后72 h，和陰性對(duì)照組(1.105±0.236)相比，MMP-9抑制組MMP-9 mRNA表達(dá)水平(0.515±0.197)明顯下降(P<0.05)，MMP-9抑制組與正常組(0.352±0.086)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各組AQP4 mRNA表達(dá) 與陰性對(duì)照組(1.122±0.175)比較，MMP-9抑制組AQP4 mRNA(0.702±0.082)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MMP-9抑制組與正常組(0.585±0.046)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4各組AQP4 蛋白表達(dá)比較 正常組細(xì)胞AQP4蛋白表達(dá)灰度值為0.655±0.086，陰性對(duì)照組為1.007±0.175，MMP-9抑制組為0.745±0.107，MMP-9抑制組明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，見圖1。

圖1 免疫印跡檢測(cè)各組細(xì)胞AQP4蛋白表達(dá)

3 討 論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多和分布廣泛的細(xì)胞群體，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要膠質(zhì)細(xì)胞，在神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)和再生、物質(zhì)代謝和神經(jīng)病理過程中具有重要作用。已有研究顯示，無論是細(xì)胞毒性腦水腫還是血管源性腦水腫，星形膠質(zhì)細(xì)胞均是腦創(chuàng)傷和腦缺血后腫脹細(xì)胞的主要類型，其腫脹均發(fā)生在腦水腫的早期，為腦水腫發(fā)展過程中的一個(gè)重要表現(xiàn)。星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹及隨后的應(yīng)激反應(yīng)可能是腦損傷后主要的早期病理現(xiàn)象〔3〕。腦缺血時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外環(huán)境、產(chǎn)生和釋放生長(zhǎng)因子，提供代謝底物支持神經(jīng)元的存活，同時(shí)參與炎癥反應(yīng)加重腦水腫的形成。腦細(xì)胞的水轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過AQP來完成，其中AQP4是腦內(nèi)表達(dá)最豐富、轉(zhuǎn)運(yùn)效率最高、主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的AQP〔3，5〕。已有研究顯示，AQP4作為介導(dǎo)水分子運(yùn)輸?shù)闹饕{(diào)節(jié)因子，其表達(dá)上調(diào)可能是腦水腫形成的一個(gè)關(guān)鍵致病因素，已證實(shí)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的代謝和大腦水平衡的調(diào)節(jié)起至關(guān)重要的作用〔6〕。目前主要觀點(diǎn)認(rèn)為，腦缺血早期AQP4的增多會(huì)導(dǎo)致水入量增多，加重腦水腫形成，而后期的AQP4則促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)過多水的流出〔7〕，在腦缺血早期短暫抑制AQP4的升高能減輕腦水腫的形成〔4〕。已有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9的過度表達(dá)和激活在心血管疾病的病理生理過程中起重要作用〔4〕，但在缺血性腦水腫中的作用機(jī)制尚不清楚。腦缺血后損傷主要表現(xiàn)為缺氧和缺糖，腦細(xì)胞損害的本質(zhì)主要是腦組織氧、糖缺乏而導(dǎo)致的結(jié)果，大多患者主要選擇性去除具有至關(guān)重要作用的葡萄糖和氧以代表缺血所致的低營(yíng)養(yǎng)條件。目前氧糖剝離是一種公認(rèn)的離體缺血缺氧模型，因此本研究采用體外缺氧缺糖處理模擬星形膠質(zhì)細(xì)胞的缺血性損傷，觀察細(xì)胞在缺血缺氧早期抑制MMP-9表達(dá)對(duì)氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4表達(dá)的影響，以期為臨床急性腦缺血的早期干預(yù)治療提供理論基礎(chǔ)。細(xì)胞培養(yǎng)使腦細(xì)胞基本保持了體內(nèi)生長(zhǎng)、發(fā)育和分化過程中的理化特點(diǎn)，且能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)直接觀察細(xì)胞在生長(zhǎng)和分化過程中形態(tài)及功能的改變，也可方便使用各種方法進(jìn)行研究，而且不受體內(nèi)多種因素的影響。MTT檢測(cè)法能比較客觀地反映細(xì)胞的活性，活細(xì)胞線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶活性決定OD值的大小，能間接反映活細(xì)胞的數(shù)目，OD值越大，活細(xì)胞越多。本研究結(jié)果提示，細(xì)胞在氧糖剝奪后，不僅不能良好生存，而且星形膠質(zhì)細(xì)胞受損必然會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)其他細(xì)胞的正常功能和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。缺血性腦水腫是導(dǎo)致腦缺血嚴(yán)重并發(fā)癥甚至死亡的關(guān)鍵病理因素，目前其發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制尚未闡明〔8〕。本研究結(jié)果表明，抑制細(xì)胞MMP-9的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均可誘導(dǎo)AQP4表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而參與影響腦水腫的進(jìn)展，提示在腦缺血的早期，MMP-9可能通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá)水平來參與缺血性腦水腫的病理生理過程，該作用可發(fā)生于基因轉(zhuǎn)錄和蛋白水平。

綜上，星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧缺糖損傷后，抑制MMP-9表達(dá)可介導(dǎo)AQP4表達(dá)下調(diào)，提示MMP-9和AQP4可能共同參與缺血性腦水腫的形成。