宋志韜 鄭丹 陳志濤 甘洪穎 吳凡 周婷婷 張姮

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430014)

胃癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤〔1〕，晚期胃癌的治療方式是以全身化療為主的綜合治療，盡管化療能夠延長腫瘤患者的生存期，但副作用較明顯〔2〕。而針對腫瘤特定靶點的小分子靶向藥物因其不良反應(yīng)較輕、耐藥率低等優(yōu)點受到關(guān)注，腫瘤進(jìn)展中的相關(guān)信號通路及異常表達(dá)的相關(guān)基因均可作為潛在的作用靶點〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(lncRNA)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等〔4〕。微小RNAs(miRNAs)是一種非編碼RNAs，調(diào)控與胃癌進(jìn)程密切相關(guān)的基因表達(dá)水平，影響胃癌的發(fā)生發(fā)展〔5〕。lncRNA可以結(jié)合miRNA參與調(diào)控胃癌進(jìn)程，了解miRNA及l(fā)ncRNA在胃癌中的具體作用機(jī)制，可以為胃癌的診治提供新思路〔6〕。本文旨在研究lncRNA LINC00176與miR-761的調(diào)控關(guān)系及其對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料 胃癌細(xì)胞MGC-803、SGC-7901和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自上海圻明生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自上海伯易生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光液、RIPA蛋白裂解液購自北京凱瑞基生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海北諾生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室、基質(zhì)膠購于美國BD公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清，將胃癌細(xì)胞MGC-803、SGC-7901和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1置于上述培養(yǎng)液中，然后置于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換一次新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞融和至70%左右時，加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 對數(shù)生長期細(xì)胞SGC-7901用無血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-761組(轉(zhuǎn)染miR-761 mimics)、pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-LINC00176組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LINC00176)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-LINC00176組(轉(zhuǎn)染si-LINC00176)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、anti-miR-761組(轉(zhuǎn)染anti-miR-761)、miR-NC+WT-LINC00176組(共轉(zhuǎn)染miR-NC和WT-LINC00176)、miR-NC+MUT-LINC00176組(共轉(zhuǎn)染miR-NC和MUT-LINC00176)、miR-761+LINC00176組(共轉(zhuǎn)染miR-761和WT-LINC00176)、miR-761+MUT-LINC00176組(共轉(zhuǎn)染miR-761和MUT-LINC00176)、pcDNA3.1-LINC00176+anti-miR-NC組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LINC00176和anti-miR-NC)、pcDNA3.1-LINC00176+ anti-miR-761組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LINC00176和anti-miR-761)，轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.4MTT檢測細(xì)胞增殖 取培養(yǎng)24、48、72 h時間點的各組細(xì)胞，然后每孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h后加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩充分反應(yīng)10 min后用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm的各孔吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.5Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 對數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)整濃度為2×104個/ml。細(xì)胞遷移實驗：分別在Transwell小室的上室和下室計入200 μl細(xì)胞懸液和500 μl培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24 h，然后用4%多聚甲醛固定，再用0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察遷移細(xì)胞數(shù)并拍照。細(xì)胞侵襲實驗：基質(zhì)膠用6倍體積的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋后，添加在Transwell小室的上室，凝固后，按照細(xì)胞遷移實驗步驟操作。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，漂洗后先后加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育20 min，然后上機(jī)檢測。實驗重復(fù)3次。

1.7qRT-PCR檢測miR-761和LINC00176表達(dá) 各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行操作，循環(huán)條件為95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)；最后60℃再延伸5 min。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，相對表達(dá)量用2-△△Ct法計算。

1.8Western印跡檢測細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、P21、Bcl-2、Bax、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、E-鈣黏蛋白(cadherin)蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，顯影、定影、成像，測定蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白相對表達(dá)水平。

1.9熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測LINC00176和miR-761的靶向關(guān)系 使用PCR擴(kuò)增包含miR-761結(jié)合位點的LINC00176序列片段，并構(gòu)建至熒光素酶表達(dá)載體中，獲得LINC00176野生型載體(WT-LINC00176)，將LINC00176序列 CAACCTGCTG突變?yōu)镃AAAGCACTG，獲得LINC00176突變型載體(MUT-LINC00176)，將WT-LINC00176、MUT-LINC00176分別與miR-NC、miR-761共轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LINC00176在胃癌細(xì)胞和正常胃黏膜細(xì)胞中的表達(dá) 與正常胃黏膜細(xì)胞GES-1(1.33±0.12)相比，胃癌細(xì)胞MGC-803、SGC-7901中LINC00176的表達(dá)水平(0.67±0.04、0.35±0.02)顯著降低(F=137.049，P=0.000)。

2.2過表達(dá)LINC00176對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-LINC00176組胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率顯著升高(P<0.05)。Western印跡檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-LINC00176組胃癌SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，P21、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-LINC00176組胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖1，圖2，表1。

2.3過表達(dá)LINC00176對胃癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響 pcDNA3.1-LINC00176組LINC00176水平(0.82±0.06)顯著高于pcDNA3.1組(0.36±0.03，t=11.877,P=0.000)。與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-LINC00176組MPP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-LINC00176組胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)。見圖3，圖4，表2。

圖1 過表達(dá)LINC00176對細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響

圖2 過表達(dá)LINC00176對細(xì)胞SGC-7901增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表1 過表達(dá)miR-761對胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、凋亡的作用

與pcDNA3.1組比較:1)P<0.05；與pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC組比較:2)P<0.05；同表2

圖3 過表達(dá)LINC00176對胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲的影響(×200)

圖4 過表達(dá)LINC00176對胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

2.4LINC00176靶向、調(diào)控miR-761 TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示LINC00176與miR-761部分序列有結(jié)合位點(圖5)。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，相較于miR-NC組(1.03±0.08)，miR-761組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-LINC00176細(xì)胞的熒光素酶活性(0.22±0.02)顯著降低(t=55.029，P=0.000)；而轉(zhuǎn)染MUT-LINC00176細(xì)胞的熒光素酶活性(1.01±0.09 vs 0.99±0.10)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.364,P=0.723)。相較于pcDNA3.1組(0.77±0.06)，pcDNA3.1-LINC00176組miR-761表達(dá)水平(0.16±0.01)顯著降低；相較于si-NC組(0.74±0.06)，si-LINC00176組miR-761表達(dá)水平(1.23±0.11)顯著升高(P<0.05)。

表2 過表達(dá)miR-761對胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲的作用

2.5抑制miR-761表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-761組CyclinD1、Bcl-2、MPP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，P21、Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測結(jié)果顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-761組胃癌SGC-7901細(xì)胞抑制率顯著升高(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-761組胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測結(jié)果顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-761組胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)。見表3，圖6。

圖5 LINC00176靶向miR-761

表3 抑制miR-761表達(dá)對胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

圖6 抑制miR-761表達(dá)對細(xì)胞SGC-7901增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

2.6過表達(dá)miR-761能逆轉(zhuǎn)LINC00176對胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 Western印跡檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC組相比，pcDNA3.1-LINC00176+miR-761組胃癌SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1、Bcl-2、MPP-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，P21、Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。MTT法檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC組相比，pcDNA3.1-LINC00176 +miR-761組胃癌SGC-7901細(xì)胞抑制率顯著降低(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC組相比，pcDNA3.1-LINC00176+miR-761組胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。Transwell 法檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC組相比，pcDNA3.1-LINC00176+miR-761組胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05)。見表1，表2，圖7。

1～4：pcDNA3.1組、pcDNA3.1-LINC00176組、pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC組、pcDNA3.1-LINC00176+miR-761組圖7 增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白的表達(dá)

3 討 論

胃癌發(fā)病率及死亡率在我國均居第二位，嚴(yán)重威脅人民生命健康〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)胃癌的進(jìn)展涉及一系列分子水平的變化，因此分子水平上的靶向治療成為腫瘤治療新的研究方向〔8〕。lncRNA是腫瘤生物學(xué)的重要組成部分，可用于胃癌的早期診斷，具有高靈敏度、高特異度等優(yōu)點〔9〕。有研究通過生物信息學(xué)方法，篩選得到胃癌組織中差異表達(dá)的lncRNA，證明LINC00176在胃癌組織中下調(diào)表達(dá)〔10〕。Ddh等〔11〕發(fā)現(xiàn)LINC00176在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，LINC00176缺失通過釋放腫瘤抑制miRNA破壞細(xì)胞周期并誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌中的壞死性凋亡。食管癌中篩選的lncRNA中LINC00176在Cox回歸分析中是負(fù)系數(shù)，說明其是保護(hù)性lncRNA，lncRNA高表達(dá)比低表達(dá)的患者總體存活期更長〔12〕。本研究結(jié)果顯示，LINC00176在胃癌細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá)LINC00176可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；且LINC00176靶向調(diào)控miR-761的表達(dá)。

研究表明miRNA參與胃癌發(fā)生、發(fā)展等過程，可作為胃癌診斷的生物標(biāo)志物及治療的潛在靶標(biāo)〔13〕。研究報道m(xù)iR-761通過靶向下調(diào)CRKL抑制了卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖〔14〕；miR-761在乳腺癌中高表達(dá)，通過靶向抑制TRIM29促進(jìn)乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移〔15,16〕。miR-761在肝癌組織中高表達(dá)，通過抑制MFN2損傷線粒體功能且抑制肝癌細(xì)胞的生長和侵襲〔17〕。miR-761在非小細(xì)胞肺癌中顯著上調(diào)表達(dá)，通過靶向ING4和TIMP2促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移〔18〕。而miR-761在結(jié)直腸癌中下調(diào)，過表達(dá)miR-761抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲，增加對5-氟尿嘧啶的敏感性〔19〕。Hsa-circ-0007534可以通過調(diào)節(jié)miR-761調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移〔20〕。miR-761在胃癌組織和細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，miR-761過表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞集落形成，miR-761可能是胃癌患者新的治療靶位點〔21〕。本研究結(jié)果顯示，抑制表達(dá)miR-761可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；過表達(dá)miR-761能逆轉(zhuǎn)LINC00176對胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、遷移、侵襲的抑制和凋亡的促進(jìn)作用。

綜上，lncRNA LINC00176可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與靶向miR-761基因有關(guān)，將可為胃癌的預(yù)防和治療提供新靶點和新思路。