(青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院心內(nèi)科，山東 煙臺 264000)

動脈粥樣硬化(AS)是由于動脈的變窄限制了富氧血液流向身體各個部位，從而引發(fā)AS相關(guān)臨床表現(xiàn)的疾病。AS與血管壁的炎癥過程、較高的低密度脂蛋白(LDL)水平具有相關(guān)性[1]，但導(dǎo)致該疾病的分子機(jī)制仍不清楚。AS的風(fēng)險因素有很多，如膽固醇異常、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖、家族史和不健康的飲食等。傳統(tǒng)的危險因素，如高血壓、糖尿病等，在預(yù)測AS方面有一定作用[2]，但不能完全預(yù)測AS風(fēng)險，因此尋找更敏感的生物標(biāo)志物，是當(dāng)前研究急需解決的問題。尋找生物標(biāo)志物有助于闡明疾病的分子機(jī)制，為疾病發(fā)生發(fā)展的預(yù)測提供更精確的證據(jù)。隨著基因測序及芯片技術(shù)的發(fā)展和成本不斷降低，生物信息學(xué)技術(shù)被廣泛用于分析疾病的基因組層面的變化，這些技術(shù)有助于識別芯片數(shù)據(jù)涉及的差異表達(dá)基因和功能通路。雖然不同廠商的芯片數(shù)據(jù)差異較大，但不同研究間還是可能具有共同的差異表達(dá)基因。因此，本研究下載并分析了來自美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)GEO數(shù)據(jù)庫的2個芯片數(shù)據(jù)集，以獲得AS組織和非AS組織的差異表達(dá)基因，尋找AS發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

以“atherosclerosis”作為關(guān)鍵詞，在NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中檢索已公布的AS的基因芯片數(shù)據(jù)集，獲取分別于2013年4月和2011年4月發(fā)表的兩個基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE43292和GSE28829。GSE43292數(shù)據(jù)集來源于里昂第一大學(xué)和北奧斯陸大學(xué)，采用Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array平臺，含有32個AS樣本和32個正常樣本的表達(dá)矩陣；該數(shù)據(jù)集選擇的是愛德華·赫里歐醫(yī)院的32例患有AS的病人，男女比例為29∶5，平均年齡為(70±10)歲，患有慢性腎臟疾病、糖尿病、自身免疫性疾病和正在進(jìn)行類固醇或其他免疫抑制藥物治療的病人均被排除在外。GSE28829來源于馬斯特里赫特大學(xué)，采用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺，含有14個AS樣本和14個正常樣本的表達(dá)矩陣；該數(shù)據(jù)集選擇的是慕尼黑伊利諾伊州立醫(yī)院的尸體和血管外科手術(shù)切除的頸動脈組織。

1.2 差異表達(dá)基因篩選及可視化

采用R語言的limma包進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析，差異表達(dá)基因的篩選條件為差異倍數(shù)log fold change>1.5、adjust<0.05；應(yīng)用R語言的plot數(shù)據(jù)包進(jìn)行畫圖與展示。

1.3 差異表達(dá)基因的功能富集分析

使用DAVID在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO基因功能分析[3]，并用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異表達(dá)基因的通路分析。以P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)篩選基因并進(jìn)行可視化展示。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

本研究使用STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)(版本10.0)進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建差異表達(dá)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，選擇綜合分?jǐn)?shù)大于0.4的主要蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，將得到的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)一步分析。Cytoscape(3.4.0版)是一個開源生物信息學(xué)軟件平臺，用于可視化分子交互網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并使用MCODE模塊以MCODE scores>5、degree cut-off=2、node score cut-off=0.2、Max depth=100、k-score=2為標(biāo)準(zhǔn)確定網(wǎng)絡(luò)中重要的區(qū)域，并進(jìn)行畫圖。

1.5 關(guān)鍵基因篩選

對上述網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行畫圖得到可能與AS相關(guān)的基因。為了驗證所得到的基因是否與AS有關(guān)，通過檢索文獻(xiàn)獲得研究支持。

2 結(jié) 果

2.1 原始數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化

進(jìn)行差異分析之前，為避免原始的基因矩陣中出現(xiàn)缺失值、基因?qū)?yīng)多個探針等情況，應(yīng)用R語言的limma包中normalize Between Arrays函數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化，隨后進(jìn)行可視化。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后兩個芯片數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)分布效果較好(圖1)，可以進(jìn)行下一步差異分析。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的聚類分析

使用R語言對標(biāo)準(zhǔn)化的GSE43292、GSE28829數(shù)據(jù)集進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖(圖2)。結(jié)果表明，GSE43292、GSE28829數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了聚類的現(xiàn)象，提示在樣本中出現(xiàn)了某些基因的富集。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

GSE43292數(shù)據(jù)集經(jīng)篩選后得到1 086個基因，其中上調(diào)基因462個，下調(diào)基因624個；GSE28829數(shù)據(jù)集經(jīng)篩選后得到1 733個基因，其中上調(diào)基因1 024個，下調(diào)基因709個?；蚝Y選后制作火山圖進(jìn)行可視化，見圖3。

2.4 差異表達(dá)基因的功能分析及通路分析

數(shù)據(jù)集GSE28829的富集分析表明，差異表達(dá)基因的細(xì)胞組分變化主要富集在細(xì)胞表面、血漿膜外側(cè)、細(xì)胞外體、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞基質(zhì)等，生物學(xué)過程主要富集在免疫球蛋白受體結(jié)合、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等。GSE43292的富集分析表明，差異表達(dá)基因的細(xì)胞組分變化主要富集于細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞基質(zhì)等，生物學(xué)過程主要富集在cAMP信號通路、細(xì)胞黏附通路、環(huán)狀體強(qiáng)化和色氨酸代謝通路等。見圖4。

2.5 差異表達(dá)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

本研究得到可能導(dǎo)致AS的潛在關(guān)鍵基因共24個：MMP9、ACP5、SPP1、FABP4、CD84、ITGB2、CHI3L1、FCGR2B、KYNU、SLAMF8、CXCL2、CXCR4、CCL18、CCL19、PL2B、TNFSF13B、APOE、MS4A4A、TIMP1、SERPINA1、IGLL5、IGL5、IGJ、TFE3、IGLL5。進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)檢索結(jié)果顯示，MMP9、FABP4、CXCR4基因與AS相關(guān)。見圖5。

A為GSE43292差異表達(dá)基因的KEGG通路分析餅圖；B為GSE43292差異表達(dá)基因的功能富集分析條形圖；C為GSE28829差異表達(dá)基因的功能富集分析條形圖；D為GSE28829差異表達(dá)基因的KEGG通路分析餅圖。

圖4 差異表達(dá)基因的功能分析和通路分析

3 討 論

AS的主要病因因素有很多，包括血液中較高水平的膽固醇和LDL、血液中低水平的高密度脂蛋白(HDL)、高血壓、煙草煙霧、糖尿病、肥胖、不健康的生活方式、家族心臟病史等。然而，該疾病的分子機(jī)制仍然沒有被闡明。隨著分子生物學(xué)發(fā)展和成本降低，基因分析、精準(zhǔn)治療成為新的診斷及治療手段。本研究使用R語言對GSE43292和GSE28829數(shù)據(jù)集進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖，結(jié)果表明，在這兩個數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)基因聚類的現(xiàn)象。通過功能富集及通路分析探索差異表達(dá)基因的功能注釋信息，并使用R語言繪制功能分析及通路分析的條形圖，結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因細(xì)胞組分主要集中在血漿膜外側(cè)、細(xì)胞基質(zhì)等，生物學(xué)過程主要富集在cAMP信號通路、細(xì)胞黏附通路等。再通過構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)篩選出了24個關(guān)鍵基因，經(jīng)文獻(xiàn)檢索顯示，其中的MMP9、FABP4、CXCR4基因與AS相關(guān)。

3.1 MMP9基因與AS相關(guān)性

纖維帽的細(xì)胞外基質(zhì)成分與冠狀動脈AS斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)，其厚度與斑塊的穩(wěn)定性呈正相關(guān)。MMPs是一種蛋白酶系，其作用可加速纖維帽細(xì)胞外基質(zhì)分解，進(jìn)而導(dǎo)致斑塊破裂。MMPs可降解很多細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原、彈性蛋白、纖維連接蛋白等。MMP9是MMPs中的一種明膠酶，它可以分解粥樣斑塊和纖維帽中內(nèi)皮基底膜的Ⅳ型膠原，增加斑塊的不穩(wěn)定性，進(jìn)而引發(fā)斑塊的破裂[4]。本研究結(jié)果表明，MMP9基因與AS的不穩(wěn)定性相關(guān)。提示MMP9可能是AS的潛在生物標(biāo)志物。

已有實驗研究驗證了MMP9和AS斑塊破裂的相關(guān)性[5]。有研究表明，高脂肪攝入的動物相較于低脂肪攝入組具有更高水平的MMP9表達(dá)[6]。也有研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測一種治療高脂血癥的傳統(tǒng)中藥的作用靶基因可能為MMP9[7]。

3.2 FABP4基因與AS相關(guān)性

脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)是游離脂肪酸的伴侶蛋白，可與膽固醇、花生四烯酸可逆性結(jié)合。該蛋白主要表達(dá)在脂肪和巨噬細(xì)胞中，參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)及脂肪分解，促進(jìn)三酰甘油在脂肪細(xì)胞中的沉積，參與AS的病程。有研究顯示，F(xiàn)ABP4通過作用于脂蛋白酯酶，使血漿游離脂肪酸水平升高，而血漿游離脂肪酸水平升高又可以導(dǎo)致高三酰甘油血癥的形成，進(jìn)而參與斑塊進(jìn)展；在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞的過程中，F(xiàn)ABP4基因表達(dá)上調(diào)，加速了泡沫細(xì)胞中膽固醇和三酰甘油的積累，從而參與斑塊的進(jìn)展[8]。另有研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP4在代謝綜合征的冠心病病人中表達(dá)升高，并且其表達(dá)與冠狀動脈AS程度和表皮脂肪組織體積有相關(guān)性[9]。也有研究顯示，F(xiàn)ABP4可以成為AS的獨立預(yù)測標(biāo)志物[10]。有回顧性分析研究顯示，血清FABP4水平與外周血管疾病的不良心血管事件具有相關(guān)性[11]。有成年小鼠的基因測序研究顯示，心臟內(nèi)皮細(xì)胞中FABP4的表達(dá)更高，F(xiàn)ABP4可能成為未來AS的重要靶基因標(biāo)志物[12]。

3.3 CXCR4基因與AS相關(guān)性

CXCR是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1的受體，參與內(nèi)皮損傷、修復(fù)過程。業(yè)已證實，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷誘發(fā)的細(xì)胞黏附、血小板聚集等過程，參與了AS過程的開啟。CXCR4可介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞向損傷區(qū)域的動員，促進(jìn)損傷區(qū)域血管內(nèi)膜的增生，進(jìn)而參與內(nèi)膜的修復(fù)過程。有研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞中CXCR4的缺失，可降低細(xì)胞的增殖，進(jìn)而影響創(chuàng)面的愈合，加速巨噬細(xì)胞浸潤，從而導(dǎo)致AS過程的進(jìn)展[13]。此外，有實驗研究表明，小鼠CXCR4的敲除或抑制阻斷了CXCL12對TCF21和ABCA1表達(dá)的影響，以及GSK3β和β-catenin的磷酸化，而小鼠中過度表達(dá)CXCL12可擴(kuò)大AS病變區(qū)域，可能導(dǎo)致AS斑塊中巨噬細(xì)胞的滲透[14]。

有研究表明，使用新型CXCR4定向正電子發(fā)射斷層掃描示蹤劑，相較于傳統(tǒng)的正電子發(fā)射斷層掃描示蹤劑能夠檢測出更多的AS斑塊[15-16]。另有研究表明，CXCR4在B-1細(xì)胞中的表達(dá)與血漿中針對malondialdehyde-modified LDL的IgM抗體呈正相關(guān)，與冠狀動脈斑塊的程度呈負(fù)相關(guān)[17]。有基因研究顯示，BPIFB4可能調(diào)節(jié)CXCR4，參與小鼠AS和炎癥進(jìn)展，這為未來的基因治療AS提供了可能[18]。有研究顯示，CXCL12與CXCR4結(jié)合可能是AS的新治療靶點[19]。也有研究顯示，亞臨床心血管疾病病人CXCR4表達(dá)降低，提示CXCR4可能是亞臨床心血管疾病的保護(hù)基因[20]。

綜上所述，本研究共確定了24個關(guān)鍵基因，其中文獻(xiàn)支持MMP9、CXCR4和FABP4基因與AS相關(guān)，它們可能是AS的生物標(biāo)志物。除MMP9、FABP4和CXCR4外，其他的21個基因在本研究中差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義，也可能與AS相關(guān)，但需要進(jìn)一步的研究來闡明這些基因與AS發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。本研究結(jié)果可為AS的分子診斷和治療開發(fā)提供算法預(yù)測和數(shù)據(jù)分析支持。