(1 河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院)胸外科,河南 洛陽 471000； 2 安陽市人民醫(yī)院胸外科)

食管癌發(fā)病是由多種因素共同作用的結(jié)果，隨著基因高通量測序技術(shù)的發(fā)展，長鏈非編碼RNA(lncRNA)被認(rèn)為在多種癌癥發(fā)展中扮演重要角色[1-2]。已有研究結(jié)果表明，lncRNA參與人體細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)活動，其在多種惡性腫瘤發(fā)展中也發(fā)揮作用[3-6]。尿路上皮癌相關(guān)基因1(UCA1)是癌癥調(diào)節(jié)耐藥基因，參與多種腫瘤的惡性發(fā)展[7-12]，如胃癌、肺癌、直腸癌等。UCA1是一種來源于人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(HERV-H)家族的lncRNA分子，其基因定位于人類第19號染色體(19p13.12)，全長為1.4 kb。lncRNAUCA1最初在膀胱癌被發(fā)現(xiàn)，并能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[13]。目前，lncRNAUCA1在食管癌中表達(dá)及其作用研究報道較少。本文對lncRNAUCA1在食管鱗癌中表達(dá)及其對癌細(xì)胞黏附和遷移的調(diào)控進(jìn)行分析，探討lncRNAUCA1用于食管鱗癌病人早期診斷及術(shù)后監(jiān)測的臨床價值?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016年5月—2018年5月，收集在本院接受手術(shù)治療的52例食管鱗癌病人作為研究對象，男性28例，女性24例，年齡48～72歲，平均(62.8±7.6)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有病人均經(jīng)術(shù)后組織病理檢查證實為食管鱗癌，手術(shù)前均未給予化療及放療處理。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝腎功能異常、免疫缺陷、其他惡性腫瘤，以及并發(fā)高血壓、糖尿病等全身系統(tǒng)疾病者。該組病人均自愿接受手術(shù)，對本次研究均知情同意。本研究經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器和試劑

1.2.1主要儀器 全自動組織包埋機(日本櫻花集團)；光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；實時熒光定量PCR(qRCR)儀(CFX96型，美國Bio-Rad公司)；Eppendorf Research移液器(德國Eppendorf公司)；臺式低溫超速離心機(德國Eppendorf公司)；-80 ℃冰箱(美國Thermo公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)等。

1.2.2主要試劑 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶(中國)公司)，Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)，All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection kit(美國Gene Copoeia公司)，PCR擴增引物、DEPC水(生工生物工程(上海)技術(shù)有限公司)，氯仿、異丙醇、無水乙醇(中國國藥集團)，胎牛血清(德國PAN公司)，2.5 g/L的胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素注射液(新賽美生物科技有限公司)，人食管鱗癌細(xì)胞系Eca109、KYSE170、KYSE150、KYSE9706、KYSE30、TE1和TE13(上海弘順生物科技有限公司)，質(zhì)粒si-uca1、si-nc和pc-dna-uca1(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成)。

1.3 實驗方法

1.3.1標(biāo)本獲取及處理 取病人原發(fā)灶處部分癌組織及距離原發(fā)灶邊緣3～5 cm正常組織。標(biāo)本切除后立即分為兩部分：一部分在新鮮狀態(tài)下用RNA保存液保存以提取RNA；另一部分用40 g/L甲醛溶液固定，做成蠟塊保存，用于HE染色。

1.3.2lncRNAUCA1表達(dá)的qPCR檢測 Trizol法提取總RNA，采用qPCR兩步法進(jìn)行檢測。設(shè)計lncRNAUCA1引物，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，配制qPCR反應(yīng)體系，設(shè)置反應(yīng)程序(95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s)進(jìn)行qPCR擴增。通過軟件得到Ct值，單位為HU。

1.3.3食管癌細(xì)胞遷移和侵襲實驗 采用劃痕試驗和Transwell侵襲實驗分別檢測UCA1基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞遷移能力和侵襲能力的影響。構(gòu)建表達(dá)載體并提取重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒si-UCA1/pc-DNAUCA1進(jìn)行鑒定，隨后進(jìn)行大量的提取和純化，測定其濃度和純度，保存?zhèn)溆?。將重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后提取RNA進(jìn)行熒光定量驗證轉(zhuǎn)染效率。以腫瘤細(xì)胞膜著色判斷為陽性，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞染色強度判斷基因表達(dá)結(jié)果，其中≥3+為過表達(dá)，<3+為低表達(dá)。按操作說明進(jìn)行劃痕試驗，在倒置顯微鏡下觀察劃痕后0、12、24 h的劃痕間距，計算細(xì)胞遷移率。根據(jù)操作說明進(jìn)行Transwell侵襲實驗，計數(shù)透過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 癌組織和癌細(xì)胞UCA1表達(dá)

食管鱗癌組織和癌旁組織的HE染色見圖1。qPCR結(jié)果表明，原發(fā)灶癌組織中UCA1的Ct值為(1.52±0.56) HU，癌旁組織為(0.95±0.36) HU，兩者比較差異有顯著意義(t=6.174，P<0.01)。UCA1在人食管癌細(xì)胞系中的相對表達(dá)量分別為：Eca109(0.61±0.08)、KYSE170(0.52±0.11)、KYSE150(0.31±0.05)、KYSE9706(0.29±0.19)、KYSE30(0.28±0.18)、TE1(0.21±0.11)和TE13(0.22±0.12)，均明顯高于正常食管上皮細(xì)胞NE1(0.07±0.03)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=107.26，P<0.01)。并且Eca109、KYSE170細(xì)胞中UCA1表達(dá)相對較高，而在TE1和TE13細(xì)胞中UCA1的表達(dá)較其他細(xì)胞系低。因此，選擇代表性的食管癌細(xì)胞系Eca109、KYSE170、TE1和TE13進(jìn)行后續(xù)相關(guān)的研究。

2.2 UCA1表達(dá)對食管癌細(xì)胞遷移影響

在12和24 h細(xì)胞的劃痕間距百分比結(jié)果表明，與Eca109及KYSE170細(xì)胞比較，過表達(dá)UCA1基因明顯抑制食管癌細(xì)胞系TE1和TE13遷移能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=187.38～243.88，P<0.01)；與TE1和TE13細(xì)胞比較，低表達(dá)UCA1基因能夠明顯促進(jìn)食管癌細(xì)胞系Eca109和KYSE170的遷移能力，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(F=133.00～1 252.32，P<0.01)。見表1。

UCA1基因時間(t/h)Eca109KYSE170TE1TE13過表達(dá)1275.78±8.1877.42±5.2867.42±2.7850.23±8.342458.54±4.2153.42±6.2843.58±3.7835.21±4.52低表達(dá)1263.38±4.5661.32±4.4244.28±2.6844.32±10.062456.32±4.3642.05±3.2520.75±3.9315.98±3.72

注：UCA1基因過表達(dá)細(xì)胞12 h遷移能力比較，F(xiàn)=187.38，P<0.01；UCA1基因過表達(dá)細(xì)胞24 h遷移能力比較，F(xiàn)=243.88，P<0.01；UCA1基因低表達(dá)細(xì)胞12 h遷移能力比較，F(xiàn)=133.00，P<0.01；UCA1基因低表達(dá)細(xì)胞24 h遷移能力比較，F(xiàn)=1 252.32，P<0.01。

2.3 UCA1表達(dá)對食管癌細(xì)胞侵襲影響

UCA1過表達(dá)的TE1和TE13細(xì)胞能夠透過人工基底膜的數(shù)量明顯高于Eca109和KYSE170，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1 388.68，P<0.01)。提示UCA1基因的過度表達(dá)顯著促進(jìn)了TE1和TE13食管癌細(xì)胞系的侵襲性。UCA1低表達(dá)的Eca109和KYSE170細(xì)胞透過人工基底膜的數(shù)量明顯低于TE1和TE13，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=426.20，P<0.01)。提示UCA1基因的低表達(dá)顯著抑制了食管癌細(xì)胞系Eca109和KYSE170的侵襲性。見表2。

UCA1基因Eca109KYSE170TE1TE13過表達(dá)267.21±11.90291.24±19.13434.52±13.28393.65±16.74低表達(dá)224.72±17.06208.68±24.12301.18±11.63309.06±17.02

注：過表達(dá)組侵襲能力比較，F(xiàn)=1 388.68，P<0.01；低表達(dá)組侵襲能力比較，F(xiàn)=426.22，P<0.01。

3 討 論

lncRNAs能夠在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等不同水平上調(diào)控基因表達(dá)。國外的研究結(jié)果顯示，lncRNAs的異常表達(dá)在各種惡性腫瘤的發(fā)生過程中起著重要作用[14-17]。腫瘤的發(fā)生是原癌基因激活、抑癌基因失活和細(xì)胞的永生化等過程所致，正常細(xì)胞有完善調(diào)控系統(tǒng)使有抑癌作用和致癌作用lncRNAs處于動態(tài)平衡，而在腫瘤細(xì)胞中這種平衡被打破。研究顯示，UCA1在多種腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用，如胃癌、胰腺癌和宮頸癌等[18-21]。

本文對UCA1在食管鱗癌中的表達(dá)水平及其對腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附調(diào)控作用進(jìn)行探討。qPCR結(jié)果表明，原發(fā)灶癌組織中UCA1的Ct值明顯高于癌旁非腫瘤組織，說明腫瘤組織中的UCA1表達(dá)水平明顯升高，這與已有報道結(jié)果相符[22-24]。說明UCA1與食管癌的發(fā)生有一定關(guān)系，提示UCA1有可能作為食管癌的腫瘤標(biāo)志物。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移涉及細(xì)胞外基質(zhì)的降解和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，細(xì)胞間黏附破壞對上皮可塑性的維持非常重要，該過程由鈣黏蛋白介導(dǎo)，這已被證實是癌癥的最初事件[25]。在腫瘤的發(fā)展過程中，細(xì)胞黏附破壞是一個重要的侵襲和轉(zhuǎn)移事件。本文對UCA1表達(dá)在食管鱗癌細(xì)胞侵襲和遷移中的影響進(jìn)行觀察，研究結(jié)果顯示，低表達(dá)UCA1可抑制Eca109和KYSE170細(xì)胞遷移能力，過表達(dá)UCA1促進(jìn)了TE1和TE13細(xì)胞遷移能力；低表達(dá)UCA1抑制了Eca109和KYSE170細(xì)胞的侵襲能力，過表達(dá)UCA1促進(jìn)了TE1和TE13細(xì)胞侵襲能力。這表明過表達(dá)的UCA1可以促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，反之，干擾UCA1則起到相反的作用。國外通過流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，低表達(dá)UCA1基因可以上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)N-cadherin、Snail和Vimentin的表達(dá)，抑制食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；過表達(dá)UCA1基因可以下調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)N-cadherin、Snail和Vimentin的表達(dá)，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[26]。

綜上所述，lncRNAUCA1在食管鱗癌呈高表達(dá)水平，促進(jìn)食管癌細(xì)胞侵襲和遷移能力，抑制了食管癌細(xì)胞凋亡。本研究同時也證實，血清lncRNAUCA1可作為食管鱗癌病人診斷的新型潛在的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物，值得臨床推廣應(yīng)用。