(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南 鄭州 450052)

目前關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制尚未完全闡明[1-2]。既往研究已表明，體腔化生、血管轉(zhuǎn)移等均可能引發(fā)子宮內(nèi)膜異位癥，而人異位子宮內(nèi)膜細胞(HEEC)惡性增殖及凋亡能力降低是子宮內(nèi)膜異位癥的主要病理機制[3-4]。因此，深入探究HEEC增殖及凋亡的分子機制有助于提高子宮內(nèi)膜異位癥治療效果。研究已表明，微小RNA-141(microRNA-141，miR-141)在子宮內(nèi)膜異位癥病人中表達下調(diào)，但關(guān)于其具體作用機制尚未明確[5-6]。miR-141是微小RNA-141-3p(microRNA-141-3p，miR-141-3p)的前體，關(guān)于miR-141-3p對HEEC生物行為的影響及其機制研究相對較少。已有研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥病人中高遷移率族蛋白 B1(HMGB1)的表達水平升高，其可能通過調(diào)節(jié)新生血管生成而參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過程[7]。Target Scan網(wǎng)站預(yù)測顯示，HMGB1可能是miR-141-3p的靶基因，但miR-141-3p是否可通過靶向調(diào)控HMGB1而影響HEEC的增殖及凋亡尚未明確。為此，本研究探討miR-141-3p表達對HEEC增殖及凋亡的影響，分析其與HMGB1的靶向調(diào)控關(guān)系及其可能作用機制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016年2月—2018年10月，選取本院收治的45例子宮內(nèi)膜異位癥病人為研究對象，年齡35～60歲，平均(45.52±5.62)歲。臨床分期[8]：Ⅱ期10例，Ⅲ期20例，Ⅳ期15例。所有病人均經(jīng)手術(shù)病理證實為子宮內(nèi)膜異位癥，術(shù)前3個月內(nèi)未服用性激素類藥物，于術(shù)中切取異位內(nèi)膜組織。同時，選取同期因婦科良性病變進行子宮切除術(shù)的43例病人為對照組，年齡為42～60歲，平均(56.72±7.13)歲。所有病人均經(jīng)手術(shù)病理證實，術(shù)中切取正常子宮內(nèi)膜組織。排除合并其他生殖系統(tǒng)腫瘤者。兩組病人年齡、月經(jīng)周期等相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，病人均知情并簽署同意書。

1.2 實驗材料

DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司；Ⅰ型膠原酶購自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司；miR-141-3pmimics、miR-141-3p抑制劑(anti-miR-141-3p)及其各自陰性對照試劑均購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒購自上海生物工程股份有限公司；Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA裂解液購自美國Sigma公司；兔抗人Cyclin D1、Bcl-2、P21、Bax抗體購自美國Abcam公司；HRP標(biāo)記的IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人HMGB1抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1體外原代培養(yǎng)HEEC 應(yīng)用差速梯度離心與細胞貼壁時間差等方法分離異位內(nèi)膜腺上皮細胞及間質(zhì)細胞。剪碎膜組織，Ⅰ型膠原酶(2 g/L)消化60 min，用100目濾網(wǎng)過濾，將含有PBS的DMEM培養(yǎng)液加入濾液內(nèi)，4 ℃條件下，以700 r/min離心7 min，棄上清，接種至培養(yǎng)皿(間質(zhì)細胞)，加入含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)液，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)[9]。

1.3.2實驗分組 待HEEC傳代至第3代時，收集生長狀態(tài)良好的HEEC，隨機分為miR-NC組(細胞中轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-141-3p組(轉(zhuǎn)染miR-141-3pmimics的細胞)。嚴(yán)格按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書的步驟進行操作，轉(zhuǎn)染6 h后更換含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集對數(shù)生長期的細胞完成功能驗證實驗。

1.3.3qRT-PCR檢測miR-141-3p表達水平 采用Trizol法分別提取正常子宮內(nèi)膜組織、異位子宮內(nèi)膜組織、HEEC的總RNA，依次分別加入200 μL 氯仿與500 μL異丙醇，4 ℃下、12 000 r/min離心15 min，棄上清，RNA沉于管底。以體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇洗滌RNA沉淀，晾干后加入適量無RNA酶水，充分溶解RNA，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR法檢測miR-141-3p相對表達量。反應(yīng)條件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共循環(huán)40次。miR-141-3p以U6為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計算miR-141-3p的表達水平。

1.3.4MTT檢測細胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后各組的HEEC，胰蛋白酶消化，制備細胞懸浮液，以每孔3×105個細胞的密度接種于96孔板。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時每孔入MTT溶液20 μL，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μL，低速振蕩10 min。利用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度(A)。每組實驗均重復(fù)3次。

1.3.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組對數(shù)生長期HEEC，PBS洗滌，胰蛋白酶消化，4 ℃下、10 000 r/min離心5 min。PBS洗滌細胞，分別加入200 μL結(jié)合緩沖液，依次加入5 μL 的Annexin V-FITC與5 μL 的PI，室溫避孵育20 min。置于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。 每組實驗均重復(fù)3次。

1.3.6熒光素酶報告基因檢測 靶基因預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測miR-141-3p的靶基因，預(yù)測顯示miR-141-3p與HMGB1的3′UTR存在結(jié)合位點，將含有miR-141-3p結(jié)合位點及其突變位點的HMGB1-3′UTR片段插入PGL3熒光素酶報告基因載體，構(gòu)建野生型(WT-HMGB1)與突變型(MUT-HMGB1)的熒光素酶報告載體。實驗分為4組：WT-HMGB1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組、WT-HMGB1+miR-141-3pmimics共轉(zhuǎn)染組、MUT-HMGB1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組、MUT-HMGB1+miR-141-3pmimics共轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組相對熒光素酶活性。每組實驗均重復(fù)3次。

1.3.7蛋白免疫印跡(Western blot)檢測HMGB1、Cyclin D1、Bcl-2、P21、Bax蛋白表達 分別取各組HEEC，加入細胞裂解液裂解細胞，4 ℃條件下、12 000 r/min離心15 min。收集上清，BCA法測定蛋白濃度。蛋白煮沸變性，取30 μg蛋白上樣進行100 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(稀釋比1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，TBST清洗；加入二抗(稀釋比1∶2 000)，室溫孵育30 min，TBST洗膜。應(yīng)用ECL試劑盒進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，置于凝膠成像系統(tǒng)并應(yīng)用Quantity One軟件定量分析蛋白條帶灰度值。每組實驗均重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 正常和異位子宮內(nèi)膜組織miR-141-3p表達

本文qRT-PCR檢測結(jié)果表明，正常與異位子宮內(nèi)膜組織中miR-141-3p表達水平分別為0.87±0.08和0.17±0.02，異位子宮內(nèi)膜組織中miR-141-3p表達水平較正常子宮內(nèi)膜顯著降低，差異有顯著意義(t=56.880，P<0.001)。

2.2 miR-141-3p過表達對HEEC增殖與凋亡及相關(guān)蛋白影響

HEEC中轉(zhuǎn)染miR-141-3pmimics后，與miR-NC組(對照組)相比，miR-141-3p組(實驗組)細胞活力顯著降低(t=10.972～13.403，P<0.001)，細胞凋亡率顯著升高(t=18.233，P<0.001)，Cyclin D與Bcl-2蛋白的水平降低(t=24.931、25.456，P<0.001)，P21與Bax蛋白的水平則升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.312、20.175，P<0.001)。見圖1與表1、2。

A：miR-141-3p過表達對HEEC凋亡的影響；B：miR-141-3p過表達對HEEC增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達的影響。對照組：miR-NC；實驗組：miR-141-3p。

圖1 miR-141-3p過表達對HEEC增殖與凋亡及相關(guān)蛋白影響

與對照組比較，*t=10.972～25.456，P<0.001。

分組Bax蛋白Bcl-2蛋白凋亡率(χ/%)對照組0.27±0.030.80±0.088.31±0.81實驗組 0.82±0.08* 0.13±0.01* 22.16±2.13*

與對照組比較，*t=18.233～24.931，P<0.001。

2.3 miR-141-3p靶向?qū)MGB1蛋白表達的影響

Target Scan預(yù)測顯示，HMGB1的3′UTR含有miR-141-3p的互補序列。見圖2A。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，WT-HMGB1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組、WT-HMGB1+miR-141-3pmimics共轉(zhuǎn)染組、MUT-HMGB1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組和MUT-HMGB1+miR-141-3pmimics共轉(zhuǎn)染組HMGB1的相對熒光素酶活性分別為1.05±0.10、0.27±0.03、1.07±0.10和1.02±0.09，HEEC細胞中轉(zhuǎn)染miR-141-3pmimics可顯著降低含有miR-141-3p結(jié)合位點熒光報告載體的相對熒光素酶活性(n=9，t=22.413，P<0.001)；后兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.115，P>0.05)。Western blot的檢測結(jié)果顯示，miR-NC組、miR-141-3p組、anti-miR-NC組和anti-miR-141-3p組HMGB1蛋白表達分別為0.63±0.06、0.21±0.02、0.64±0.06和0.99±0.10，各組比較差異有顯著性(n=9，F(xiàn)=208.278，P<0.001)。miR-141-3p過表達后，細胞中HMGB1蛋白的水平為0.21±0.02，與miR-NC組的0.63±0.06相比較顯著降低(t=19.922，P<0.05)；抑制miR-141-3p表達后，細胞中HMGB1蛋白水平為0.99±0.10，與anti-miR-NC組的0.64±0.06相比較顯著升高(t=9.004，P<0.05)。見圖2B。表明HMGB1是miR-141-3p的靶基因，miR-141-3p可負性調(diào)控HMGB1的表達。

A：HMGB1的3′UTR含有miR-141-3p的互補序列。B：Western blot檢測HMGB1表達，a為miR-NC組、b為miR-141-3p組、c為anti-miR-NC組、d為anti-miR-141-3p組。

圖2miR-141-3p靶向?qū)MGB1蛋白表達的影響

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥主要指子宮腔被覆內(nèi)膜外存在子宮內(nèi)膜組織生長及浸潤。研究表明，miRNA可通過調(diào)控下游靶基因表達而參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過程[10-12]。但仍有部分miRNA在子宮內(nèi)膜異位癥中的機制尚未完全闡明，因此本研究探尋新型miR-141-3p在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過程中的可能作用機制。miR-141-3p在腫瘤細胞中呈低表達，miR-141-3p過表達后可顯著抑制細胞增殖及其侵襲能力，誘導(dǎo)細胞凋亡[13-20]。但是，miR-141-3p在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達及其作用機制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，miR-141-3p在異位子宮內(nèi)膜組織中呈低表達，說明miR-141-3p表達降低可能參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過程。本文進一步研究顯示，miR-141-3p過表達后，HEEC的增殖能力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達下調(diào)，P21、Bax蛋白表達上調(diào)。已有報道指出，Cyclin D1可正向調(diào)控細胞周期進程，促進細胞增殖；P21可以通過抑制Cyclin D1與CDK4結(jié)合而阻滯細胞周期進程，抑制細胞增殖[21-26]。Bcl-2、Bax蛋白是HEEC凋亡過程中的重要作用因子，Bcl-2蛋白表達升高可抑制HEEC凋亡，而Bax蛋白表達升高可促進HEEC凋亡[27]。說明miR-141-3p過表達可通過干擾細胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白而調(diào)節(jié)HEEC的增殖及凋亡行為。即miR-141-3p過表達可抑制HEEC的增殖，促進其凋亡。

HMGB1在子宮內(nèi)膜異位癥病人血清中的表達水平升高，并可作為子宮內(nèi)膜異位癥診斷的重要指標(biāo)[28]。HMGB1屬于DNA結(jié)合蛋白。研究表明，HMGB1可促進炎癥反應(yīng)及血管生成，還可通過調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程[29。相關(guān)研究報道指出，HMGB1還可通過促進Treg細胞分泌及增強其介導(dǎo)的免疫抑制作用而參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過程[30]。本研究結(jié)果表明，miR-141-3p可靶向調(diào)控HMGB1表達。提示miR-141-3p過表達可能通過靶向調(diào)控HMGB1而抑制HEEC增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥病人中miR-141-3p的表達明顯降低，miR-141-3p過表達可能通過調(diào)控HMGB1的表達而抑制HEEC的增殖及促進其凋亡。本研究結(jié)果為揭示子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制奠定理論基礎(chǔ)，為子宮內(nèi)膜異位癥治療提供了新的思路。但關(guān)于miR-141-3p在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生及發(fā)展過程中，具體通過調(diào)控哪種信號通路而發(fā)揮作用尚需進一步探究。