侯欣,王志偉,賈夢英,楊芳,宋慧琴2,段永建

(河南大學第一附屬醫(yī)院,河南 開封 475001 1 腫瘤科； 2 病理科)

肺癌病死率極高[1]，尤以非小細胞肺癌為著，預后極差[2-3]。組蛋白脫乙酰酶9(HDAC9)是一種轉錄抑制因子，可參與機體生長發(fā)育過程[4]，在多種癌癥中表達異常[5-7]。Wnt蛋白是生物發(fā)育過程所需的分泌型蛋白生長因子[8]。癌基因可通過激活或抑制經典的Wnt信號通路，參與腫瘤的進程[9-11]。目前，有關HDAC9基因與非小細胞肺癌關系的研究尚不多見。本研究探討了HDAC9基因沉默對非小細胞肺癌細胞生物學特性和 Wnt 信號通路的影響，以期為非小細胞肺癌發(fā)病的分子機制和臨床治療機制研究奠定理論基礎，從而為肺癌診療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

體積分數(shù)為0.10的胎牛血清(上海索寶生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、BPMI 1640培養(yǎng)基和2.5 g/L胰蛋白酶(Hyclon公司，美國)；非小細胞肺癌細胞株A549(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)；Lipofectamin 2000、RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，美國)；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；免疫印跡(Western blot)抗體(武漢博士德公司)；CCK8試劑(Sigma公司，美國)；酶聯(lián)免疫檢測儀(上海精密儀器儀表有限公司)；甲紫染色劑(碧云天生物技術有限公司)；鈣離子依賴性磷脂結合蛋白和碘化丙啶(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)。

1.2 非小細胞肺癌細胞培養(yǎng)

使用含體積分數(shù)0.10的胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，將A549培養(yǎng)在37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中，待細胞達到80%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞的分組及轉染

取A549采用含體積分數(shù)0.10胎牛血清并加入雙抗的BPMI 1640培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h。細胞隨機分組為：Blank組(a組，不轉染任何序列)、NC組(b組，轉染HDAC9陰性對照序列)、pcDNA-HDAC9組(c組，轉染HDAC9過表達載體)、si-HDAC9組(d組，轉染si-HDAC9)、si-HDAC9+rWnt3a組(e組，轉染沉默HDAC9同時加入Wnt信號通路激動劑rWnt3a刺激細胞)。將處于對數(shù)生長期的各組細胞接種于6孔板中，細胞生長至30%～50%融合時，按Lipofectamin 2000說明書轉染細胞。培養(yǎng)24～48 h后，進行后續(xù)實驗。

1.4 檢測指標及實驗方法

1.4.1基因表達的qRT-PCR檢測 分別收集各組A549細胞培養(yǎng)48 h后，采用RNA提取試劑盒提取RNA。分別設計HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5和GAPDH引物，交由Takara公司合成。使用Prime Script RT試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄體系10 μL，參照說明書進行。取反應液進行熒光定量PCR，參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行。在ABI PRISM?7300系統(tǒng)進行熒光定量PCR檢測。以GAPDH為內參，分別計算HDAC9、JNK、β-catenin和Wnt-5相對表達水平。每組實驗重復3次，每次取3個樣本。

1.4.2蛋白表達的Western blot檢測 收集轉染48 h后A549，加蛋白裂解液，離心取上清液分裝備用。測定各樣品蛋白濃度，去離子水調整，確保上樣量一致。配制100 g/L SDS分離膠與濃縮膠。樣品與加樣緩沖液混合，100 ℃煮沸5 min，冰浴、離心后進行電泳分離，再將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。50 g/L脫脂奶粉4 ℃封膜過夜。滴加一抗(兔抗鼠多克隆抗體HDAC9、JNK、β-catenin和Wnt-5)孵育過夜；PBS洗滌3次后滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，37 ℃振蕩孵育1 h。TBST 洗膜，辣根過氧化物酶ECL顯影，掃描記錄。利用Image J軟件對目的條帶進行灰度值分析。每組實驗重復3次，每次取3個樣本。

1.4.3細胞增殖的CCK8檢測 將各組細胞分別接種于96孔板。待各組轉染24 h后，PBS液洗2次，2.5 g/L胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。調整細胞密度(3 000～ 6 000個細胞)，接種于96孔板中，重復6孔，置于培養(yǎng)箱，分別于培養(yǎng)24、48、72 和96 h時取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL的CCK8繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm波長處讀取各孔光密度(OD)值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞活力曲線圖。每組實驗重復3次，每次取3個樣本。

1.4.4劃痕實驗檢測細胞遷移 取轉染24 h 各組細胞，將細胞接種于6孔板中，細胞生長完全融合后，用 10 μL槍頭在孔板中心軸處沿直線輕輕劃痕。培養(yǎng)24 h后在光學顯微鏡下觀察拍照，以細胞劃痕愈合百分比表示細胞遷移能力。每組實驗重復3次，每次取3個樣本。

1.4.5Transwell實驗檢測細胞侵襲 轉染后48 h消化收集各組細胞，使用含體積分數(shù)0.01胎牛血清的DEME重懸細胞。取各組細胞懸液200 μL加入Transwell小室，下室加750 μL含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DEME，置37 ℃孵箱內繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后取出小室，用甲醇固定30 min，再以1 g/L甲紫染色20 min，棉簽輕輕擦去上層未遷移細胞。在400倍光學顯微鏡下隨機選取5個視野觀察細胞并計數(shù)。每組實驗重復3次，每次取3個樣本。

1.4.6流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞轉染后96 h，用不含EDTA的胰蛋白酶消化；使用4 ℃預冷PBS洗滌，棄上清液，結合緩沖液重懸細胞；移取100 μL細胞懸液于流式管內，加入鈣離子依賴性磷脂結合蛋白和1 g/L碘化丙啶各5 μL；室溫避光反應15 min；加入400 μL結合緩沖液，1 h內進行流式細胞術檢測。每組實驗重復3次，每次取3個樣本。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 HDAC9基因沉默檢測

qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，與NC組細胞相比較，si-HDAC9組細胞的HDAC9mRNA(0.99±0.05 vs. 0.43±0.04)和蛋白(1.01±0.06 vs. 0.59±0.04)表達水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(t=15.15、10.09，P<0.05)。

2.2 HDAC9基因沉默對Wnt信號通路影響

qRT-PCR和Western blot檢測HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5的mRNA和蛋白表達結果表明，各基因mRNA和蛋白表達組間差異有顯著性(FmRNA=66.590～155.800，P均<0.05；F蛋白=83.110～159.400，P均<0.05)。Blank組和NC組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與NC組相比，pcDNA-HDAC9組各基因mRNA和蛋白表達水平均上升(tmRNA=5.125～15.990，P均<0.05；t蛋白=6.775～13.690，P均<0.05)；si-HDAC9組均明顯下降(tmRNA=3.966～13.930，P均<0.05；t蛋白=4.342～9.992，P均<0.05)；且與si-HDAC9組相比，si-HDAC9+rWnt3a組各基因mRNA和蛋白表達水平水平逆轉，呈上升趨勢(tmRNA=15.390～16.800，P均<0.05；t蛋白=11.230～21.420，P均<0.05)。 見圖1。

2.3 HDAC9基因沉默對細胞增殖影響

CCK8檢測顯示，各組細胞增殖能力在0 h時無明顯差異(P>0.05)；在24～96 h細胞增殖能力組間差異有顯著性(F=9.070～66.850，P<0.05)。Blank組和NC組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與NC組相比，pcDNA-HDAC9組中細胞增殖速度在48～96 h均明顯加快(t=3.571～10.590，P均<0.05)；而si-HDAC9組在24～96 h顯著減慢(t=4.045～12.860，P均<0.05)；且與si-HDAC9組相比，si-HDAC9+rWnt3a組細胞增殖速度在24～96 h逆轉，呈上升趨勢(t=2.921～3.807，P均<0.05)。見圖2A。

2.4 HDAC9基因沉默對細胞遷移和侵襲影響

劃痕實驗和Transwell侵襲的研究結果顯示，細胞遷移和侵襲能力的組間差異有顯著意義(F=13.000、19.690，P均<0.05)。Blank組與NC組比較無明顯差異(P>0.05)；與NC組相比，pcDNA-HDAC9組中細胞遷移和侵襲能力顯著增強(t=2.933、3.728，P均<0.05)；而si-HDAC9組顯著減弱(t=3.437、5.116，P均<0.05)；且與si-HDAC9組相比，si-HDAC9+rWnt3a組細胞遷移和侵襲能力逆轉，呈上升趨勢(t=3.984、4.032，P均<0.05)。見圖2B、C。

2.5 HDAC9基因沉默對細胞凋亡影響

流式細胞術檢測結果表明，Blank組、NC組、pcDNA-HDAC9組、si-HDAC9組和si-HDAC9+rWnt3a組的細胞凋亡率分別為(28.75±1.77)%、(30.24±1.68)%、(20.61±1.40)%、(41.20±2.32)%和(24.52±1.42)%，細胞凋亡組間比較差異有顯著性(F=58.990，P<0.05)。Blank組與NC組細胞凋亡率差異無顯著性(P>0.05)；與NC組相比較，pcDNA-HDAC9組中細胞凋亡顯著降低(t=7.627，P<0.05)；而si-HDAC9組細胞凋亡顯著升高(t=6.627，P<0.05)；且與si-HDAC9組相比，si-HDAC9+rWnt3a組細胞凋亡逆轉，呈下降趨勢(t=10.620，P<0.05)。見圖3。

3 討 論

肺癌死亡率居世界第1位[12-13]。我國肺癌死亡率亦呈逐年上升趨勢[14-15]。肺癌預后極差。究其原因在于腫瘤轉移率和復發(fā)率高，腫瘤細胞具有免疫逃逸、自我更新及再生等干細胞特性[16-17]。

HDACs是一類轉錄抑制因子[18]，可分為四大類，HDAC9隸屬于Ⅱ型中的Ⅱa型，參與分化和發(fā)育過程[19]。其在多數(shù)腫瘤中呈高表達[20-21]。此外，經典Wnt信號通路主要通過3種途徑調節(jié)細胞行為并介導細胞間相互作用，如Wnt/β-catenin通路、Wnt/PcR通路以及Wnt/Ca2+途徑[22]，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[23-25]。非小細胞肺癌中常伴隨Wnt信號通路的激活[26]。本研究之初推測，通過小分子干擾RNA、抗Wnt信號通路相關因子表達或其他方法，可抑制Wnt信號通路激活，抑制下游相關蛋白表達，阻斷非小細胞肺癌的發(fā)展。本文基于這一推論，驗證HDAC9基因沉默介導Wnt信號通路對非小細胞肺癌細胞生物學特性的作用機制。

本文的研究結果顯示，HDAC9沉默序列能明顯降低HDAC9基因的mRNA和蛋白表達，從而沉默HDAC9基因。同時，pcDNA-HDAC9轉染細胞后HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5表達水平上升；而si-HDAC9轉染導致各因子表達水平下降。因此，相較于HDAC9表達上調對癌細胞Wnt信號通路相關蛋白的表達的影響，HDAC9沉默表達可抑制Wnt信號通路的激活。另外，本文同時設立si-HDAC9+rWnt3a組，旨在支持沉默HDAC9表達對Wnt信號通路的激活的抑制作用。rWnt3a為Wnt信號通路的激動劑[27]，通過轉染si-HDAC9和rWnt3a，沉默HDAC9表達對JNK、β-catenin和Wnt-5表達的抑制作用逆轉，證實本文推測的合理性。同時，si-HDAC9轉染導致細胞生長受到抑制，細胞增殖、遷移和侵襲能力明顯降低，凋亡增加；且si-HDAC9+rWnt3a轉染可逆轉si-HDAC9轉染后的上述趨勢。因此，HDAC9基因沉默可以抑制Wnt信號通路的激活，從而參與對非小細胞肺癌細胞生物學特性的調節(jié)。

A為qRT-PCR檢測各組mRNA表達；B為Western blot檢測各組蛋白表達；C為各蛋白電泳條帶圖。a：Blank組，b：NC組，c：pcDNA-HDAC9組，d：si-HDAC9組，e：si-HDAC9+rWnt3a組。與Blank組和NC組比較，*P<0.05；與si-HDAC9組比較，#P<0.05。

圖1 各組細胞中HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5的mRNA及蛋白表達檢測

A為細胞增殖能力變化；B為細胞遷移數(shù)變化；C為細胞侵襲數(shù)變化。a：Blank組，b：NC組，c：pcDNA-HDAC9組，d：si-HDAC9組，e：si-HDAC9+rWnt3a組。與Blank組和NC組相比，*P<0.05；與si-HDAC9組相比，#P<0.05。

圖2 各組細胞增殖、遷移和侵襲能力的檢測

總之，本研究證實HDAC9沉默表達可通過抑制Wnt信號通路激活，抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移與侵襲并促進細胞凋亡，為非小細胞肺癌的靶向治療提供了潛在分子靶點。Wnt信號通路是一個復雜網絡體系，且與其他信號轉導途徑關聯(lián)密切[28-29]。非小細胞肺癌中是否還存在Wnt信號通路與其他途徑的相互作用尚未明確；HDAC9沉默表達是否可作為特異性靶基因，并介導非小細胞肺癌細胞耐藥，均有待于未來進一步探究。