(青島大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東 青島 266003)

糖尿病心肌病(DCM)是由糖尿病引起的心肌特異性病變，是糖尿病病人致殘致死的主要原因[1]。

DCM的病理機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，包括代謝紊亂、慢性低度炎癥、微血管結(jié)構(gòu)及功能障礙、自主神經(jīng)功能紊亂、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等[2]。研究表明，心肌細(xì)胞凋亡增加在DCM的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用[3]。自噬是指通過(guò)溶酶體途徑選擇性降解細(xì)胞組分，繼而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身代謝需要及循環(huán)更新胞質(zhì)成分的過(guò)程，在某些情況下，自噬激活被認(rèn)為具有心臟保護(hù)作用[4]。有研究表明，通過(guò)促進(jìn)自噬可緩解凋亡，防治DCM，提示調(diào)控自噬可能是治療DCM的有效策略[5]。黃芪多糖(APS)是黃芪的主要活性成分之一，不僅具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、雙向調(diào)節(jié)血糖、保護(hù)心肝腎等多種藥理活性，還可改善DCM[6]。我們的前期研究表明，APS通過(guò)抑制內(nèi)、外源性凋亡途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善DCM大鼠心功能[7]。近年來(lái)的研究結(jié)果表明，APS可抑制MAP4K3表達(dá)和mTOR信號(hào)的下傳，而上調(diào)自噬，通過(guò)恢復(fù)自噬通量可改善心肌細(xì)胞功能[8]。然而，APS是否可通過(guò)影響DCM大鼠心肌細(xì)胞自噬進(jìn)而改善心肌細(xì)胞凋亡尚不清楚。因此，本研究用APS進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡和自噬途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只，7～8周齡，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫(25±1)℃，濕度(50±10)%，明暗周期12 h，自由飲水和攝食。所有動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作均獲得青島大學(xué)動(dòng)物福利和倫理管理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2主要藥物及試劑 APS(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%)；鏈脲佐菌素(STZ，Sigma-Aldrich)；檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH值4.5，索萊寶公司)；RIPA裂解液和蘇木精-伊紅染色試劑盒(碧云天公司)；LC3和p62抗體(Cell Signaling Technology，USA)；GAPDH抗體(Abcam，USA)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(索萊寶公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche，USA)。

1.1.3儀器和設(shè)備 羅氏優(yōu)越型血糖儀(ACCU CHEK Advantage，Roche, Germany)；Vevo?2100超高分辨率小動(dòng)物彩色多普勒超聲實(shí)時(shí)影像系統(tǒng)(VisualSonics，Canada)；電泳儀(Bio-Rad，USA)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetic，USA)；石蠟切片機(jī)(Leica RM2265)；全功能微孔板檢測(cè)儀(BIO-TEK，USA)；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(Olympus BX53，Japan)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食不禁水12 h后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、DCM組和APS治療組(APS組)，每組10只。DCM組和APS組大鼠一次性腹腔注射10 g/L的STZ溶液50 mg/kg[9](注射前用0.1 mol/L、pH值4.5的檸檬酸鈉緩沖液在冰上避光配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)以誘導(dǎo)1型糖尿病模型，NC組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。分別于注射后第3、7天，禁食12 h后從尾靜脈采血測(cè)空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L且伴有“三多一少”癥狀者視為造模成功。同時(shí)，參考既往研究[10]，APS組一次性灌胃給予APS溶液1 g·kg-1·d-1進(jìn)行干預(yù)，而NC組和DCM組灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)干預(yù)16周。

1.2.2血糖和體質(zhì)量監(jiān)測(cè) 動(dòng)物自飼養(yǎng)開(kāi)始，于每周末同一時(shí)間稱量并記錄大鼠的體質(zhì)量，在禁食12 h后經(jīng)尾靜脈采血測(cè)空腹血糖。

1.2.3超聲心動(dòng)圖評(píng)估心功能 實(shí)驗(yàn)16周后，采用體積分?jǐn)?shù)0.03異氟烷霧化吸入麻醉大鼠，由同一專業(yè)人員使用小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)檢測(cè)經(jīng)胸二維超聲心動(dòng)圖，獲得以下心功能指標(biāo)：左心室舒張末期直徑(LVEDD)、左心室收縮末期直徑(LVESD)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)、縮短分?jǐn)?shù)(FS)和射血分?jǐn)?shù)(EF)。重復(fù)測(cè)量6個(gè)連續(xù)的心動(dòng)周期。

1.2.4心肌組織病理觀察 心功能評(píng)估結(jié)束后，腹腔注射水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠，迅速分離出心臟，用大量生理鹽水洗去其內(nèi)殘留血液后，將心臟沿心室中間橫向平分，取部分左心室組織浸泡于40 g/L多聚甲醛中固定24 h以上，4 μm石蠟切片后，行蘇木精-伊紅、TUNEL染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察相關(guān)病理改變。

1.2.5Western blot檢測(cè)心肌組織內(nèi)p62和LC3蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液提取心肌組織總蛋白，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度[11]。根據(jù)測(cè)試結(jié)果，將樣品濃度調(diào)至1 g/L，并加入適量4×SDS上樣緩沖液，95 ℃變性10 min。SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。牛奶封閉膜2 h，以TBST洗膜3次后，加相應(yīng)的一抗室溫下孵育2 h，再洗膜3次，然后加與一抗結(jié)合的二抗室溫下孵育1.5 h。以TBST洗膜3次后，使用ECL顯影劑顯影相關(guān)蛋白條帶，用Image J圖像分析軟件分析灰度值，計(jì)算p62和LC3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)評(píng)估

除去造模失敗、死亡及狀態(tài)不佳不合格大鼠后，每組有6只大鼠納入實(shí)驗(yàn)研究及數(shù)據(jù)分析。STZ注射后，DCM組和APS組大鼠出現(xiàn)明顯的多飲、多尿、多食等糖尿病癥狀，DCM組大鼠體質(zhì)量較NC組明顯下降，血糖較NC組明顯升高，說(shuō)明模型建立成功。APS干預(yù)后，與DCM組相比，APS組大鼠體質(zhì)量明顯增加，血糖明顯降低，說(shuō)明APS可改善糖尿病大鼠的體質(zhì)量和血糖。

2.2 各組大鼠心功能比較

與NC組相比，DCM組大鼠LVEDD、LVESD、LVESV、LVEDV顯著增大，EF、FS顯著下降(F=5.584～342.701，t=3.125～18.648，P<0.05)，提示其心功能下降。而APS干預(yù)可顯著減小LVEDD、LVESD、LVESV、LVEDV，并抑制FS的下降(t=2.503～13.416，P<0.05)，說(shuō)明APS干預(yù)可一定程度改善DCM大鼠心功能。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心功能相關(guān)參數(shù)比較

與NC組相比，F(xiàn)=5.584～342.701，*t=3.125～18.648，P<0.05；與DCM組相比，#t=2.503～13.416，P<0.05。

2.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變

NC組大鼠心肌細(xì)胞完整，肌纖維排列有序，無(wú)凋亡及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DCM組大鼠心肌組織發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大和排列紊亂、肌纖維斷裂、細(xì)胞邊界不清和大小不一。APS組大鼠心肌組織排列較DCM組整齊，心肌細(xì)胞凋亡減少，炎癥較輕，說(shuō)明APS可顯著改善DCM心肌組織病理改變。

2.4 APS對(duì)DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡影響

干預(yù)16周后，TUNEL染色結(jié)果顯示，NC組、DCM組和APS組的細(xì)胞凋亡率分別為(11.48±2.44)%、(55.84±7.84)%和(16.31±4.06)%。與DCM組相比，APS組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯下降(F=23.931，t=9.157，P<0.05)，說(shuō)明APS干預(yù)可抑制DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

2.5 APS對(duì)DCM大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響

干預(yù)16周后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于NC組，DCM組大鼠心肌組織內(nèi)LC3蛋白表達(dá)顯著降低，而p62蛋白表達(dá)顯著升高(F=11.341、22.155，t=4.439、9.409，P<0.05)，表明在DCM大鼠中心肌細(xì)胞自噬受到抑制。而與DCM組相比，APS組大鼠心肌組織內(nèi)LC3蛋白表達(dá)上調(diào)，p62蛋白表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.714、9.682，P<0.05)，說(shuō)明APS干預(yù)可恢復(fù)DCM大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)自噬水平，從而發(fā)揮保護(hù)作用。見(jiàn)表2。

組 別 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰp62/GAPDHNC組1.33±0.12 0.84±0.07 DCM組0.82±0.11*1.53±0.11*APS組1.24±0.18#0.82±0.08#

與NC組相比，F(xiàn)=11.341、22.155，*t=4.439、9.409，P<0.05；與DCM組相比，#t=3.714、9.682，P<0.05。

3 討 論

糖尿病引起的心血管并發(fā)癥的發(fā)病率及死亡率在全球逐年上升，并帶來(lái)高經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，值得重視[12]。其中，DCM是糖尿病病人發(fā)生心力衰竭的主要原因，然而，DCM的確切病理生理機(jī)制尚不清楚。DCM發(fā)病緩慢隱匿，早期即發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能異常，包括左心室肥大、心肌纖維化、舒張功能障礙和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常[13]。本研究結(jié)果顯示，DCM組大鼠LVEDD、LVESD、LVESV、LVEDV增大，EF、FS下降，表明其心功能下降；而蘇木精-伊紅染色提示DCM大鼠心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，TUNEL染色提示心肌細(xì)胞凋亡增加。我們的前期研究顯示，APS可有效緩解DCM的心肌細(xì)胞凋亡，改善大鼠心功能[7]。本實(shí)驗(yàn)APS組大鼠心臟超聲相關(guān)指標(biāo)的改變進(jìn)一步表明，APS可改善DCM大鼠心功能；蘇木精-伊紅及TUNEL染色表明，APS組大鼠心肌結(jié)構(gòu)及心肌細(xì)胞凋亡得到有效改善。但其具體的分子機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步探討。

自噬是一種具有高度保守性、可選擇性地降解過(guò)多或有害胞質(zhì)成分(如受損的線粒體或蛋白多聚體)的過(guò)程，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用[14]。有關(guān)研究表明，在DCM中自噬不足，而上調(diào)自噬可阻礙DCM進(jìn)展[15]。AMPK的激活可恢復(fù)心臟自噬，可防止心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能[16]。在肝臟中，APS以與二甲雙胍類似的方式抑制促凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和上調(diào)受抑制的自噬，恢復(fù)肝功能[17]。此外，APS預(yù)處理可恢復(fù)因阿霉素抑制的心臟自噬，減輕心臟損傷，改善心功能[8]。LC3參與自噬體形成到成熟的各個(gè)階段，是目前研究自噬最常用的標(biāo)志物，主要包括LC3-Ⅰ(胞質(zhì)狀態(tài))和LC3-Ⅱ(膜結(jié)合狀態(tài))。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3-Ⅰ被活化，結(jié)合磷脂酰乙醇胺轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ，促進(jìn)自噬體形成及成熟[14]，LC3-Ⅱ的變化水平與自噬程度呈正相關(guān)，可部分反映自噬水平。此外，在選擇性自噬中，p62作為自噬受體被特異性招募至自噬體內(nèi)降解，因此也常被作為檢測(cè)自噬水平的指標(biāo)。目前，采用Western blot方法檢測(cè)LC3-Ⅱ的變化及輔助性檢測(cè)p62水平是評(píng)估自噬的主要方法[18]。本文研究通過(guò)Western blot檢測(cè)表明，DCM組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白表達(dá)較NC組顯著降低，伴隨p62蛋白表達(dá)升高，表明DCM組心肌細(xì)胞自噬受到抑制；而APS干預(yù)后，與DCM組相比，APS組大鼠心肌組織內(nèi)LC3蛋白表達(dá)上調(diào)，p62蛋白表達(dá)下降。提示APS可能通過(guò)自噬途徑有效減少DCM心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，APS能夠有效恢復(fù)自噬活性，減輕糖尿病所致的心肌細(xì)胞凋亡。