(青島大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,山東 青島 266000)

白內(nèi)障是由增齡、免疫和代謝異常、局部營養(yǎng)障礙、創(chuàng)傷等多種原因引起的晶狀體代謝紊亂，使晶狀體蛋白發(fā)生變性，最終導(dǎo)致晶狀體混濁。白內(nèi)障是導(dǎo)致老年人視力障礙的主要原因之一，位居我國致盲性眼病首位[1]。目前白內(nèi)障的治療仍以手術(shù)治療為主，但藥物治療同樣重要。研究發(fā)現(xiàn)，晶狀體上皮細胞凋亡在白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展過程中起重要的作用[2-3]。D-半乳糖介導(dǎo)的嚙齒動物衰老模型已廣泛應(yīng)用于衰老相關(guān)性疾病及抗衰老研究。褐藻膠寡糖(AOS)屬于海藻寡糖，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抑制凋亡等生物學(xué)活性。AOS對D-半乳糖誘導(dǎo)的白內(nèi)障的作用鮮有報道。本實驗通過D-半乳糖誘導(dǎo)制備C57BL/6J小鼠白內(nèi)障模型，探討AOS對D-半乳糖誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠白內(nèi)障的影響及其可能的作用機制,為白內(nèi)障的藥物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

C57BL/6J小鼠購于濟南鵬躍實驗動物繁育中心；AOS購于青島博智匯力生物科技有限公司；D-半乳糖、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶公司；Bax兔多克隆抗體、Bcl-xl和β-actin兔單克隆抗體、caspase-3鼠單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG二抗購于武漢伊萊瑞特公司；RIPA裂解液購于上海碧云天公司。

1.2 實驗方法

1.2.1小鼠分組及處理 45只8周齡C57BL/6J雄性小鼠于青島大學(xué)實驗動物中心(SPF級)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。實驗期間保持室內(nèi)溫度18～22 ℃，相對濕度40%～60%，明/暗周期為12 h，小鼠自由進食和飲水。應(yīng)用隨機數(shù)字表法將45只小鼠分為對照組(A組)、D-半乳糖組(B組)、D-半乳糖+AOS低劑量組(C組)、D-半乳糖+AOS中劑量組(D組)和D-半乳糖+AOS高劑量組(E組)，每組9只。A組小鼠于頸背部皮下注射滅菌注射用水(5 mL·kg-1·d-1)8周，其余各組小鼠均頸背部皮下注射D-半乳糖(200 mg·kg-1·d-1)8周。自實驗第5周開始，A、B兩組小鼠給予蒸餾水10 mL·kg-1·d-1灌胃處理4周，C、D、E組小鼠分別給予AOS 50、100、150 mg·kg-1·d-1灌胃處理4周。該動物實驗經(jīng)青島大學(xué)動物福利和倫理管理委員會批準(zhǔn)，且遵守《動物保護與使用指南》。

1.2.2晶狀體混濁度觀察及評分 實驗結(jié)束后，摘取小鼠眼球并在生理鹽水中清洗3次，解剖顯微鏡下分離晶狀體。根據(jù)SIPPEL[4]描述的晶狀體混濁度評分標(biāo)準(zhǔn)，將晶狀體混濁度分為0～5分。0分：晶狀體透明，無空泡；1分：晶狀體透明，空泡少于3個；2分：晶狀體透明，空泡多于3個；3分：空泡覆蓋整個晶狀體表面；4分：晶狀體部分混濁；5分：晶狀體完全混濁。

1.2.3蘇木精-伊紅染色(HE染色) 應(yīng)用HE染色觀察晶狀體細胞形態(tài)變化。將摘取的眼球在生理鹽水中清洗3次，迅速置于40 g/L甲醛緩沖溶液中固定，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片后經(jīng)過脫水、HE染色、透明、封片處理后，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察晶狀體上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.2.4Western blot方法檢測晶狀體Bax、Bcl-xl和caspass-3蛋白的表達 收集各組小鼠至少10個晶狀體樣本，應(yīng)用4 ℃磷酸鹽緩沖液沖洗3次，濾紙吸干后稱質(zhì)量，按質(zhì)量體積比1∶9加入4 ℃的磷酸鹽緩沖液，于冰上經(jīng)研磨棒充分研磨后，制成100 g/L的晶狀體勻漿，低溫12 000 r/min離心5 min，留取上清液。加入RIPA裂解液提取蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度加入晶狀體蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，當(dāng)溴酚藍到達底部時將分離膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(200 mA、90 min)，封閉液封閉2 h，分別加入1∶1 000稀釋的Bax、Bcl-xl和caspase-3一抗工作液，4 ℃孵育過夜；TBS-T洗膜1 h后加入1∶5 000稀釋的二抗工作液，室溫孵育2 h；TBS-T洗膜1 h，應(yīng)用ECL發(fā)光液顯影，并應(yīng)用Quantity One 軟件進行灰度分析。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示各蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠晶狀體混濁度得分比較

A組、B組、C組、D組、E組小鼠晶狀體混濁度得分分別為：0.44±0.72、4.44±0.73、3.67±0.71、2.78±0.97、1.22±0.67。與對照組比較，D-半乳糖組晶狀體混濁度評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.347，P<0.05)；與D-半乳糖組相比，不同濃度AOS干預(yù)組晶狀體混濁度評分明顯降低，并且呈濃度依賴性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組小鼠晶狀體HE染色結(jié)果比較

對照組小鼠晶狀體上皮細胞呈單層排列，整齊有序；D-半乳糖組小鼠晶狀體上皮細胞稍腫脹，細胞排列不均勻；AOS 150 mg·kg-1·d-1灌胃處理顯著改善了晶狀體上皮細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列紊亂。見圖1A～C。

2.3 各組小鼠晶狀體Bax、Bcl-xl和caspase-3蛋白表達比較

與對照組相比，D-半乳糖組小鼠晶狀體Bcl-xl蛋白表達明顯減少，Bax、caspase-3的蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.62～9.16，P<0.05)；與D-半乳糖組相比，D-半乳糖+AOS各劑量組(C、D、E組)小鼠晶狀體Bcl-xl的蛋白表達明顯增加，Bax、caspase-3的蛋白表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同濃度AOS干預(yù)組小鼠晶狀體Bcl-xl的蛋白表達呈濃度依賴性增加，E組與C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同濃度AOS干預(yù)組小鼠晶狀體Bax、caspase-3蛋白表達呈濃度依賴性減少，E組與C組、D組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表1。

3 討 論

白內(nèi)障是老年人常見致盲性眼病，衰老是老年人白內(nèi)障的重要病因之一。研究表明，晶狀體上皮細胞受損與白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展有密切聯(lián)系，除先天性白內(nèi)障外，晶狀體上皮細胞凋亡在多種類型白內(nèi)障發(fā)生中起重要作用[5-6]。D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老模型被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建衰老嚙齒類動物模型，廣泛應(yīng)用于增齡性聽力下降[7]、白內(nèi)障[8]、記憶障礙[9]、腎臟衰老[10]、心臟衰老[11]等研究。高劑量半乳糖可誘導(dǎo)產(chǎn)生過量活性氧，從而促進晶狀體上皮細胞的脂質(zhì)過氧化[12]。此外，多項研究表明，D-半乳糖通過損傷晶狀體上皮細胞促進白內(nèi)障形成[13-14]。晶狀體上皮細胞凋亡是多種類型白內(nèi)障發(fā)生的細胞學(xué)基礎(chǔ)[6,15-16]。研究表明，經(jīng)D-半乳糖處理后的動物表現(xiàn)為氧化應(yīng)激損傷與糖基化反應(yīng)同時存在，導(dǎo)致晶狀體上皮細胞的細胞核和線粒體功能、結(jié)構(gòu)損傷，進一步引起細胞凋亡[17-18]。此外，D-半乳糖在氧化酶的作用下分解形成木酮糖和CO2，并產(chǎn)生氧自由基和H2O2，導(dǎo)致晶狀體氧化損傷，進一步導(dǎo)致晶狀體混濁[19]。本實驗結(jié)果表明，應(yīng)用D-半乳糖處理后的小鼠晶狀體混濁度評分明顯增加，細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xl蛋白的表達明顯降低，Bax、caspase3蛋白表達明顯增加，表明D-半乳糖可以誘導(dǎo)白內(nèi)障的發(fā)生，其機制可能與細胞凋亡有關(guān)。

組別BaxBcl-xlcaspase-3A組1.00±0.001.00±0.001.00±0.00B組1.78±0.160.42±0.171.47±0.23C組1.28±0.230.71±0.271.37±0.17D組1.13±0.301.04±0.231.21±0.27E組0.62±0.361.15±0.190.57±0.37

根據(jù)晶狀體的混濁程度可進行白內(nèi)障病情分級。晶狀體混濁通常從周邊開始出現(xiàn)空泡，逐漸向中心發(fā)展，最終出現(xiàn)核混濁[20]。病理改變主要表現(xiàn)為晶狀體細胞結(jié)構(gòu)破壞以及晶狀體纖維水腫、崩解等[21-22]。AOS因其無免疫原性、無毒性、可生物降解等優(yōu)點而被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。已有研究表明，AOS對肺動脈高壓[23]、心血管疾病[24]、腎臟損傷[25]等具有重要保護作用，但其對白內(nèi)障的影響卻鮮有研究。本研究結(jié)果顯示，D-半乳糖組小鼠晶狀體混濁度評分明顯升高，AOS干預(yù)顯著改善了晶狀體上皮細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列紊亂，表明D-半乳糖誘導(dǎo)了C57BL/6J小鼠白內(nèi)障的發(fā)生，AOS顯著延緩了D-半乳糖誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠白內(nèi)障的進展。本研究顯示，應(yīng)用不同濃度的AOS干預(yù)后，小鼠晶狀體混濁度呈濃度依賴性降低，高劑量組降低效果最為明顯；晶狀體上皮細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列紊亂得到明顯改善；且細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xl表達呈劑量依賴性增加，而Bax、caspase3蛋白表達呈劑量依賴性減少，以高劑量組效果最為明顯。表明AOS可以延緩白內(nèi)障的發(fā)生，其機制可能與抑制細胞凋亡有關(guān)。

細胞凋亡是為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在基因調(diào)控下的細胞程序性死亡，受多種基因如Bcl-2家族Bax、Bcl-xl以及caspase家族中的caspase-3等調(diào)控。Bax屬于Bcl-2家族中重要的凋亡調(diào)節(jié)基因，Bax的過度表達可以拮抗Bcl-2的保護作用，從而促進細胞凋亡。Bcl-xl是Bcl-2家族基因中重要的拮抗細胞凋亡基因，可與Bax結(jié)合形成異二聚體，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[26-28]。JING等[29]在研究過氧化氫誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞凋亡時發(fā)現(xiàn)，Bax、caspase-3的mRNA表達明顯增加，表明其在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。caspase-3是近年來發(fā)現(xiàn)的在細胞凋亡中起關(guān)鍵作用的蛋白酶[30-31]。有研究表明,老年白內(nèi)障病人和中青年白內(nèi)障病人晶狀體上皮細胞凋亡與caspase-3的表達水平呈正相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，與對照組相比較，D-半乳糖組小鼠晶狀體Bcl-xl蛋白表達明顯減少，Bax、caspase-3蛋白表達明顯增加；與D-半乳糖組相比，AOS干預(yù)各組小鼠晶狀體Bcl-xl的蛋白表達呈劑量依賴性增加，Bax、caspase-3蛋白表達呈劑量依賴性減少，以高劑量組效果最為明顯，表明白內(nèi)障的發(fā)生與細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xl、Bax和caspase-3的表達有關(guān)。

綜上所述，AOS顯著延緩了D-半乳糖誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠白內(nèi)障的進展，其機制可能與AOS抑制晶狀體細胞凋亡有關(guān)。但其具體分子調(diào)控機制仍需進一步研究。