李鳳姿， 張 媛， 王小壘， 吳 昊， 楊洪巖

（東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

東北酸菜是以新鮮白菜為原料，主要依靠乳酸菌發(fā)酵獲得的地域性家常特色食物，具有香氣濃郁、味道鮮美、組織嫩脆、可增進(jìn)食欲等特點(diǎn)。市場(chǎng)需求的不斷擴(kuò)大推動(dòng)著酸菜產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的加快，但如今東北酸菜的多數(shù)加工企業(yè)由于技術(shù)缺乏、急于上市等原因仍采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵方式生產(chǎn)酸菜，并在成品酸菜中添加防腐劑[1]，嚴(yán)重影響著酸菜產(chǎn)品質(zhì)量及安全性。在酸菜生產(chǎn)中應(yīng)用人工接種發(fā)酵不僅可以控制發(fā)酵進(jìn)程、縮短產(chǎn)品的成熟時(shí)間，而且能得到質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，減少防腐劑的使用[2]。應(yīng)用乳酸菌對(duì)酸菜進(jìn)行接種發(fā)酵是未來(lái)酸菜生產(chǎn)的必然趨勢(shì)。

根據(jù)發(fā)酵類型可以將乳酸菌分為兩類：異型發(fā)酵乳酸菌和同型發(fā)酵乳酸菌。異型發(fā)酵乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸、乙酸、CO2等產(chǎn)物，而同型發(fā)酵乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中主要產(chǎn)生乳酸。接種的乳酸菌種類不同，發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性和生化特性也有所不同。選擇從原始產(chǎn)品中分離出的同時(shí)是優(yōu)勢(shì)菌屬的乳酸菌作為接種劑可以更有效地降低發(fā)酵失敗的風(fēng)險(xiǎn)，得到與自然發(fā)酵風(fēng)味更接近的產(chǎn)品[3-5]。東北酸菜自然發(fā)酵過(guò)程中占優(yōu)勢(shì)的、不同發(fā)酵類型的菌株有短乳桿菌、彎曲乳桿菌、植物乳桿菌、寡發(fā)酵乳桿菌等[6-7]。在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)，向自然酸菜發(fā)酵體系中加入同型發(fā)酵乳桿菌和異型發(fā)酵乳球菌的作用效果不同，乳桿菌對(duì)于酸菜發(fā)酵起著主導(dǎo)作用[8]。但不同種的乳桿菌對(duì)于酸菜發(fā)酵進(jìn)程的影響尚不明確，而這些數(shù)據(jù)的積累又是篩選高效穩(wěn)定的酸菜發(fā)酵接種劑所必須的。

基于此，本研究篩選異型發(fā)酵乳桿菌短乳桿菌、寡發(fā)酵乳桿菌和同型發(fā)酵乳桿菌彎曲乳桿菌、植物乳桿菌，分別對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜進(jìn)行接種，通過(guò)生理生化指標(biāo)和微生物多樣性分析探索不同種類乳桿菌對(duì)酸菜發(fā)酵效果的影響，為篩選高效穩(wěn)定的酸菜接種劑奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與菌種

白菜：購(gòu)自黑龍江省綏化市，實(shí)驗(yàn)全程為同一品種；菌種：作者所在實(shí)驗(yàn)室從自然發(fā)酵酸菜樣品中分離的短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、寡發(fā)酵乳桿菌（L.oligofermentans）、彎曲乳桿菌（L.curvatus）和植物乳桿菌（L.plantarum）。

1.2 儀器與設(shè)備

微型pH計(jì)：日本Horiba公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器；Nanovue：美國(guó)GE公司產(chǎn)品；高效液 相色譜 （Highperformanceliquid chromatography，HPLC）：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；HPX-87H色譜柱：美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 接種乳酸菌的篩選 從自然發(fā)酵的酸菜中分離的10株L.brevis、10株L.oligofermentans、5株L.curvatus、10株L.plantarum中各篩選一株生產(chǎn)迅速、酸積累量多的菌株。具體為：將從-70℃取出經(jīng)二次活化的L.brevis、L.oligofermentans、L.curvatus、L.plantarum單菌落接種于液體MRS葡萄糖培養(yǎng)基中，L.brevis、L.curvatus、L.plantarum于37 ℃培養(yǎng)48 h，L.oligofermentans于25℃培養(yǎng)48 h。每隔8小時(shí)使用紫外分光光度計(jì)測(cè)OD600值；用微量pH計(jì)測(cè)定菌株培養(yǎng)液的pH值；取10 mL菌株培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋10倍后，用0.1 mol/L標(biāo)定后氫氧化鈉溶液滴定至pH值為8.3，測(cè)定其可滴定酸質(zhì)量濃度（g/L）[9]。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.2 發(fā)酵 采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵方法[7]，每缸內(nèi)裝約75 kg白菜，加入鹽（鹽與鮮菜質(zhì)量比為1∶100）和水，用腌菜石壓實(shí)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置接L.brevis、L.oligofermentans、L.curvatus、L.plantarum和 不 接 菌（對(duì)照）的5個(gè)處理，菌株接種量為106個(gè)/g。酸菜發(fā)酵完成時(shí)間為30 d，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。取樣間隔設(shè)為發(fā)酵的第0、6、12、18、24、30天。

1.3.3 微生物計(jì)數(shù)及生化指標(biāo)測(cè)定 菌落計(jì)數(shù)（CFUs）：采用平板梯度稀釋法；乳酸菌培養(yǎng)：采用MRS培養(yǎng)基，將稀釋的酸菜汁與50℃保溫的培養(yǎng)基混合均勻，30℃培養(yǎng)2 d后計(jì)數(shù)；一般細(xì)菌培養(yǎng)：采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2 d后計(jì)數(shù)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

可溶性糖（WSC）采用蒽酮比色法測(cè)定。色譜分析有機(jī)酸條件為：5 mmol/L的硫酸作為流動(dòng)相，總程序進(jìn)行時(shí)間為15 min，流速為0.5 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量為5 μL，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為205 nm。

1.3.4 DNA提取和高通量測(cè)序 提取緩沖液（Tris-HCl，pH 8.0）保存的菌體用細(xì)菌DNA提取試劑盒（Omega，USA）進(jìn)行總DNA提取。 用Nanovue超微量紫外分光光度計(jì)對(duì)所獲取的DNA進(jìn)行質(zhì)量濃度測(cè)定，提取的DNA質(zhì)量濃度應(yīng)大于50 ng/μL，提取體積大于60 μL。將提取的12 d和30 d的酸菜中所含的菌體DNA委托北京市理化分析測(cè)試中心生物部進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，去除嵌合體序列得到有效序列后，在97%的相似水平下對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分，進(jìn)而進(jìn)行聚類分析，每一個(gè)聚類稱為一個(gè)物種操作單元 （Operational Taxonomic Units，OTU），對(duì)OTU的代表序列作分類學(xué)分析?；诜诸悓W(xué)信息，在門和屬水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，綜合討論酸菜發(fā)酵不同接種處理的細(xì)菌群落。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析與處理 應(yīng)用Origin8.5軟件進(jìn)行圖表繪制；采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各乳桿菌菌株培養(yǎng)特性

本研究中液體MRS葡萄糖培養(yǎng)基的初始pH值為6.32，液體MRS木糖培養(yǎng)基的初始pH值為5.71，監(jiān)測(cè)了48 h內(nèi)每8小時(shí)的OD600、pH、可滴定酸的變化規(guī)律，結(jié)果見(jiàn)圖1。生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，在培養(yǎng)8 h后，L.curvatus生長(zhǎng)曲線便趨于平緩；在16 h后，L.oligofermentans、L.plantarum生長(zhǎng)曲線趨于平緩；L.brevis生長(zhǎng)曲線一直在緩慢上升。在48 h結(jié)束時(shí)，L.plantarum的OD600值 最 高為2.44，L.brevis最 低 為1.59。在培養(yǎng)的前16小時(shí)內(nèi)，菌株培養(yǎng)液的pH值快速下降?？傻味ㄋ峤Y(jié)果顯示，乳酸菌產(chǎn)酸能力與pH值有關(guān)，即隨著pH的下降，可滴定酸質(zhì)量濃度在逐漸增加，說(shuō)明產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株也有較強(qiáng)的耐酸性 。L.brevis、L.oligofermentans、L.curvatus和L.plantarum的可滴定酸質(zhì)量濃度在48 h時(shí)分別達(dá)到6.66、13.43、12.84、15.22 g/L。

圖1 菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酸動(dòng)態(tài)Fig.1 Dynamics of growth and acid production of four strains

2.2 酸菜發(fā)酵體系pH動(dòng)態(tài)

發(fā)酵體系的pH動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，接種乳酸菌的酸菜處理組pH下降速度比對(duì)照組快。接種乳酸菌的酸菜體系中pH的下降主要發(fā)生在前12天，對(duì)照組pH的下降主要發(fā)生在前18天。L.brevis接種的酸菜體系在第30天pH值是所有處理組中最高的。L.plantarum接種的酸菜體系pH下降最快，在第12天下降到3.5，之后其pH值也一直保持最低值。在發(fā)酵30 d結(jié)束時(shí)，所有酸菜的pH值都在4以下。

圖2 酸菜發(fā)酵體系pH和有機(jī)酸Fig.2 Dynamics of pH and organic acids （lactic acid，acetic acid）during sauerkraut fermentation

2.3 發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸（乳酸和乙酸）的質(zhì)量濃度

在以前的研究中發(fā)現(xiàn)，東北酸菜發(fā)酵體系的有機(jī)酸主要為乳酸和乙酸[7-8]。作者對(duì)這兩種有機(jī)酸進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示所有接種處理的乳酸質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)在持續(xù)上升，僅對(duì)照組在發(fā)酵的第24～30天有輕微下降。 在發(fā)酵前6天，L.curvatus與L.plantarum接種處理的酸菜發(fā)酵體系乳酸質(zhì)量濃度顯著比其他3組高 （p＜0.05）。發(fā)酵30 d時(shí)，L.curvatus接種處理的酸菜乳酸菌質(zhì)量濃度最高，達(dá)到11.79 g/L，其次為L(zhǎng).plantarum，兩組差異不顯著。在發(fā)酵過(guò)程中，所有處理組的乙酸質(zhì)量濃度也一直在上升，L.brevis、L.oligofermentans接種 處理組與對(duì)照組在發(fā)酵初期就有乙酸產(chǎn)生，而L.plantarum、L.curvatus接種的酸菜分別在發(fā)酵的第6天與第12天后才開(kāi)始有乙酸產(chǎn)生。最終，L.brevis、L.oligofermentans接種處理的酸菜發(fā)酵體系乙酸質(zhì)量濃度分別達(dá)到1.44 g/L和1.48 g/L，顯著高于其他3組。

2.4 發(fā)酵過(guò)程中的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

發(fā)酵過(guò)程中的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)圖3（a）。白菜初始可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是38.83 mg/g，可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵過(guò)程中是一直下降的。在發(fā)酵的前18天，L.brevis、L.oligofermentans接種處理組可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降的比較快，L.curvatus、L.plantarum接種處理組與對(duì)照組可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降比較慢， 在第24天時(shí)，L.curvatus、L.plantarum接種處理組可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。到發(fā)酵完成時(shí)，所有處理組的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)都在5.6 mg/g以下。乳酸菌消耗發(fā)酵原料中的可溶性糖使體系中的pH迅速下降，并產(chǎn)生大量的有機(jī)酸[10]，可溶性糖的這種下降趨勢(shì)顯示了底物的消耗狀態(tài)，與體系的pH下降及有機(jī)酸尤其是乳酸的積累趨勢(shì)相符。

2.5 發(fā)酵過(guò)程中的微生物菌落動(dòng)態(tài)

圖3（b）顯示了發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)量變化，在發(fā)酵過(guò)程的前6天，對(duì)照組的乳酸菌數(shù)量顯著少于接種乳酸菌的酸菜體系 （p＜0.05），L.curvatus與L.plantarum接種的處理組乳酸菌數(shù)量最高，分別是8.82 lg（CFU/mL）和8.7 lg（CFU/mL），這與其培養(yǎng)特性相一致。對(duì)照組乳酸菌數(shù)量到發(fā)酵第24天時(shí)一直緩慢增長(zhǎng)，在第24天到達(dá)8.38 lg（CFU/mL）。接種處理組乳酸菌的數(shù)量一直在（8～9） lg（CFU/mL）。 圖3（c）顯示了發(fā)酵過(guò)程中其他細(xì)菌數(shù)量變化，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，所有處理組的其他細(xì)菌的數(shù)量在8 lg（CFU/mL）左右。

2.6 發(fā)酵過(guò)程中各接種處理的細(xì)菌群落多樣性

2.6.1 OTU分析 對(duì)樣品進(jìn)行OTU聚類分析，涵蓋了2門、2綱、7目、16科、28屬。 不同處理組在12 d和30 d發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)OTU數(shù)量見(jiàn)圖4。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，每個(gè)處理組OTU的數(shù)量都分別降低。即在發(fā)酵期間，白菜中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被不斷消耗，pH值在不斷降低，因?yàn)槿鄙贍I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和不耐酸，樣品中的微生物種類在不斷減少。

圖3 酸菜發(fā)酵體系中的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和微生物數(shù)量動(dòng)態(tài)Fig.3 Dynamics of water-soluble carbohydrates and colony forming units during sauerkraut fermentation

圖4 發(fā)酵第12天和第30天OTU數(shù)量Fig.4 OTU at 12 d and 30 d in the fermentation

2.6.2 不同處理的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析 高通量測(cè)序結(jié)果顯示，在門的水平上，所有處理組總細(xì)菌組成主要由厚壁菌門（Firmicutes）與變形菌門（Proteobacteria）組成，占據(jù)菌群總量的99.9%，見(jiàn)圖5（a）。在發(fā)酵整個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)irmicutes始終占據(jù)主要優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度為60.2%～71.6%之間。其在所有接種處理中的相對(duì)豐度比對(duì)照組高，Proteobacteria的相對(duì)豐度較低。當(dāng)發(fā)酵達(dá)到30 d，L.plantarum的厚壁菌門相對(duì)豐度最高。

圖5 不同細(xì)菌群落在門和屬水平上的組成Fig.5 Composition of the different bacterial communities atthe phylum and genuslevelsduring the fermentation

在屬的水平上，不同的酸菜樣品共分離得到31個(gè)屬，圖5（b）為相對(duì)豐度大于0.1%的菌群分布柱狀圖。在屬水平上主要檢測(cè)到的是乳酸菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）。其它的菌屬主要包括Psudomonas、Acinetobacter、Serratia、Proteus、Klebsiella、Erwinia、Enterobacter、Citrobacter和Enterobacteriaceae等。 由圖5可知，所有處理中乳酸菌一直占據(jù)主要優(yōu)勢(shì)。對(duì)于微生物整體組成，不同接種處理存在有明顯差異。所有接種處理組中Lactobacillus的相對(duì)豐度高于對(duì)照組。Leuconostoc的比例低于對(duì)照組，Enterobacteriaceae的比例高于對(duì)照組。12 d發(fā)酵時(shí)，各處理之間比較可見(jiàn)，L.curvatus接種處理中的Lactobacillus比例較高，Enterobacteriaceae和Psudomonas的比例較低；30 d發(fā)酵時(shí)，L.plantarum處理中Lactobacillus比例較高，Enterobacteriaceae和Psudomonas的比例較低。

3 討論

采用了4種乳酸桿菌作為接種劑，從發(fā)酵體系的理化指標(biāo)和細(xì)菌群落的組成及動(dòng)態(tài)變化對(duì)接種不同種乳酸桿菌對(duì)東北酸菜發(fā)酵特性的影響進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。

pH值是評(píng)定蔬菜發(fā)酵程度的重要指標(biāo)[11-12]。pH值下降速度快，表明蔬菜進(jìn)入定向發(fā)酵越早，酸菜成熟速度也就越快。本研究中，各接種處理組酸菜的pH值下降、乳酸產(chǎn)生速度均比對(duì)照組快，說(shuō)明4種接種用乳酸桿菌均使發(fā)酵進(jìn)程顯著縮短，這與已有關(guān)于蔬菜發(fā)酵文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果類似[13]。本研究應(yīng)用高效液相色譜法分析發(fā)酵體系中的乳酸和乙酸的質(zhì)量濃度，結(jié)果顯示乳酸是酸菜中主要的有機(jī)酸，與已有的研究報(bào)道一致[14-15]。 在5組處理中，L.curvatus與L.plantarum接種處理的酸菜發(fā)酵體系乳酸質(zhì)量濃度最高，說(shuō)明同型發(fā)酵乳酸菌可以顯著提高發(fā)酵體系中的乳酸質(zhì)量濃度[16]；L.brevis和L.oligofermentans接種處理的酸菜發(fā)酵體系乙酸質(zhì)量濃度最高，且在發(fā)酵第6天，只在L.brevis、L.oligofermentans和對(duì)照組體系中檢測(cè)到乙酸，說(shuō)明乙酸主要來(lái)源于異型發(fā)酵乳酸菌的作用[17]。乙酸被認(rèn)為是有效的抗菌化合物，可以抑制發(fā)酵食品中病原真菌和腐敗菌的生長(zhǎng)[18]，適當(dāng)提高發(fā)酵酸菜中的乙酸質(zhì)量濃度，對(duì)于產(chǎn)品風(fēng)味的提高具有一定的積極作用[19]。

在發(fā)酵前6天，接種處理組乳酸菌數(shù)量高于對(duì)照組，是由于發(fā)酵開(kāi)始時(shí)接入了數(shù)量較高的乳酸菌。在發(fā)酵第12天到發(fā)酵結(jié)束，各處理組乳酸菌數(shù)量區(qū)別并不顯著，與有關(guān)的接種蔬菜發(fā)酵文獻(xiàn)報(bào)道一致[20-21]。這說(shuō)明接種處理在發(fā)酵前期對(duì)乳酸菌的數(shù)量有著顯著影響，之后隨著時(shí)間的延續(xù)影響不再顯著?？赡艿脑蚴钱?dāng)體系pH足夠低，有機(jī)酸積累到一定值時(shí)，體系內(nèi)除乳酸菌外的其它菌不再生長(zhǎng)，乳酸菌增殖也達(dá)到穩(wěn)定的結(jié)果。本研究中L.curvatus、L.plantarum接種處理組酸菜的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降速度最慢，這與以往的研究結(jié)果不一致[8]，分析可能的原因是本研究中原料中的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高，乳酸菌發(fā)酵利用可溶性糖產(chǎn)生足夠的乳酸后使體系內(nèi)的微生物消耗糖的速度減慢所導(dǎo)致。

作者用高通量測(cè)序技術(shù)分析了在第12天和第30天各處理組的細(xì)菌組成和動(dòng)態(tài)變化。在門水平上，F(xiàn)irmicutes和Proteobacteria是酸菜樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，這與以往的研究結(jié)果一致[22-23]。酸菜發(fā)酵可分為兩個(gè)階段，即由Leuconostoc占優(yōu)勢(shì)的異型發(fā)酵階段和以L.plantarum為主的同型發(fā)酵階段[24-25]。在本研究中，接種處理組Leuconostoc相對(duì)豐度低于對(duì)照組，Lactobacillus的相對(duì)豐度高于對(duì)照組。在本研究中，接種處理的酸菜體系Enterobacteriaceae和Psudomonas相對(duì)豐度低于對(duì)照組。已有的研究結(jié)果顯示，Enterobacteriaceae和Psudomonas會(huì)利用酸菜中游離的氨基酸生成破壞酸菜質(zhì)量的生物胺（主要是腐胺和尸胺）[26]，同時(shí)與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)使用糖類，減少乳酸的生成。乳酸菌會(huì)降低發(fā)酵體系的pH，生成有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等物質(zhì)抑制Enterobacteriaceae、Psudomonas和Listeria monocytogenes等食源性病原菌和腐敗菌的生長(zhǎng)[27-29]，這說(shuō)明接種處理提高了酸菜的品質(zhì)。接種處理使體系發(fā)酵前期的乳酸菌數(shù)量升高，乳酸菌可以利用少量的碳水化合物來(lái)合成大量的有機(jī)酸，進(jìn)而造成體系pH的降低，抑制Enterobacteriaceae和Psudomonas的生長(zhǎng)，這也與發(fā)酵蔬菜的研究結(jié)果一致[30-32]。

4 結(jié) 語(yǔ)

使用這4株乳酸菌接種酸菜縮短了酸菜的發(fā)酵時(shí)間，改善了酸菜的品質(zhì)。結(jié)合生理生化指標(biāo)及微生物組成分析結(jié)果，若欲使酸菜發(fā)酵體系的pH下降及乳酸積累更快，使用L.curvatus與L.plantarum更好，從終產(chǎn)品的微生物安全性來(lái)看，L.plantarum更值得推薦。本研究結(jié)果將為篩選符合不同發(fā)酵目的的接種劑提供技術(shù)參考。