王禮君 ， 馮麗妍 ， 徐建中 *， 張偉國

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

青霉素作為一種高效、廣譜的抗生素具有很強(qiáng)的抑菌殺菌作用，但是在實(shí)際生活中，特別是醫(yī)療和畜禽養(yǎng)殖業(yè)很容易過度使用而導(dǎo)致抗生素滲入環(huán)境介質(zhì)中，進(jìn)而影響環(huán)境微生物群的結(jié)構(gòu)和活性，誘導(dǎo)產(chǎn)生各類抗生素耐藥菌[1-2]。當(dāng)前，國內(nèi)外在城市污水、養(yǎng)殖場廢水與土壤中都有檢測到較高的抗生素殘留，因此從源頭上控制抗生素的使用，以及在對含抗生素的廢渣廢液進(jìn)行排放前進(jìn)行高效的處理顯得尤為重要。此外，我國是世界上最大的青霉素生產(chǎn)國和出口國，會產(chǎn)生大量的青霉素菌渣，傳統(tǒng)處理中菌渣作為廢棄物進(jìn)行填埋或者焚燒處理，浪費(fèi)了大量有機(jī)資源，且不能有效處理掉菌渣中殘留的青霉素，對環(huán)境存在巨大的潛在威脅。目前，我國還沒有完整且成熟的化學(xué)集中處理工藝，且耗資較大，不適用于菌渣大規(guī)模的處理。相比之下，利用堆肥化處理青霉素菌渣，通過堆肥過程中微生物作用降解殘留青霉素，擁有綠色、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、處理方式簡單等優(yōu)點(diǎn)。因此，從土壤或菌渣中篩選得到一種具有高效降解青霉素能力的菌株，將極大地縮短堆肥化的時(shí)間，提高菌渣中殘留青霉素降解效率，不僅實(shí)現(xiàn)了菌渣的無害化處理，還對菌渣的進(jìn)一步回收利用具有極大的實(shí)際意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

國內(nèi)已有部分關(guān)于降解青霉素的研究，例如岳喜慶[3]等分離出一株能高效降解青霉素鈉的菌WM1，在菌株接種體積分?jǐn)?shù)為10%并以青霉素鈉為惟一碳源的條件下，培養(yǎng)9 h對初始質(zhì)量濃度為10 mg/L的青霉素鈉的降解率達(dá)到100%；付歡[4]等篩選出一株對青霉素具有高效降解能力的菌JZ6，在培養(yǎng)條件為30℃、pH 6.7并且外加碳氮源的條件下，培養(yǎng)24 h可以對初始質(zhì)量濃度為300 mg/L的青霉素的降解率達(dá)到99.98%；趙娟[5]等分離出一株具有高效降解青霉素能力的菌PC-2，在接種體積分?jǐn)?shù)為14%，培養(yǎng)溫度為37℃、pH 7.0左右的培養(yǎng)條件下，外加碳氮源，培養(yǎng)6 h可使菌株對初始質(zhì)量濃度為400 mg/L的青霉素的降解率達(dá)到98%。已研究菌株對青霉素的抗性較低，降解效率雖然可在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到99%，但青霉素初始質(zhì)量濃度較低，無法滿足工業(yè)特別是一些含有較高質(zhì)量濃度的青霉素的菌渣的初步處理要求，限制了菌株在實(shí)際生產(chǎn)生活中的應(yīng)用。

作者通過從青霉素鈉生產(chǎn)企業(yè)附近的土壤樣品中分離篩選出具有較高青霉素鈉抗性的菌株，考察菌株對青霉素鈉的降解能力，并探究菌株在一定條件下的最佳降解條件，以期得到一種高濃度的青霉素鈉的高效降解菌。此菌株可用于處理含有較高濃度的青霉素鈉的菌渣、工業(yè)廢水及農(nóng)場廢棄物等，帶來更大的實(shí)際效益，實(shí)現(xiàn)安全、高效的排放。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品為取青霉素生產(chǎn)企業(yè)附近的土壤若干，青霉素鈉160萬單位，華北制藥集團(tuán)生產(chǎn)。主要儀器有電子顯微鏡、紫外可見光分光光度計(jì)、高效液相色譜儀、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀等。

1.2 主要培養(yǎng)基

LBG培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水定容至 1 000 mL，pH 7.0。

降解培養(yǎng)基：KH2PO43 g，K2HPO41 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 2 mg，MnSO42 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 2 mg，CaCl21 mg，碳源 5 g，氮源 5 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

培養(yǎng)基于121℃滅菌20 min，如要制成固體培養(yǎng)基則向培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為20 g/L的瓊脂條。對于降解培養(yǎng)基，青霉素鈉溶液過濾除菌后按一定終質(zhì)量濃度添加。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定

1）降解青霉素鈉菌株的富集和分離 稱取樣品土壤各10 g，分別放入裝有100 mL無菌水和一層玻璃珠的錐形瓶中，100 r/min搖床振蕩15 min，充分打散，制成菌懸液，取蒸餾水稀釋至10-4～10-6倍，取菌懸液150 μL涂布到含青霉素鈉質(zhì)量濃度為5 g/L的LBG培養(yǎng)基上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取生長良好的菌株逐步轉(zhuǎn)接至含青霉素鈉質(zhì)量濃度為 10、15、20、30 g/L 的 LBG 培養(yǎng)基上，選擇能耐受較高質(zhì)量濃度的青霉素鈉的菌株進(jìn)行分離純化。通過對菌落菌體的形態(tài)特征觀察初步確定菌株的種屬。

2）全基因組的提取及18S rRNA的擴(kuò)增 全基因組的提取采用康為世紀(jì)酵母基因組DNA提取試劑盒。使用通用引物ITS1和ITS4對菌株的18S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測序由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司完成。

3）序列同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 根據(jù)測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast比對，并在MEGA 7.0軟件中用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1 000次Bootstraps檢驗(yàn)。

1.3.2 青霉素鈉降解菌株生長曲線的測定 挑取1～2環(huán)菌株接入LBG培養(yǎng)基中，30℃搖瓶培養(yǎng)至菌液渾濁后以1%接種體積分?jǐn)?shù)接入降解培養(yǎng)基中，并于最適生長條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，定時(shí)取樣測定菌液的OD600值。

1.3.3 青霉素鈉降解菌降解效率的測定

1）樣品制備與液相色譜條件 向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為10 g/L的青霉素鈉，含有最佳碳氮源的降解培養(yǎng)基記作第一組，不加入碳氮源的降解培養(yǎng)基記作第二組。取于最佳生長條件下培養(yǎng)32 h的發(fā)酵液1 mL加入4 mL緩沖液 （乙腈∶水=4∶1）中，混勻后10 000 r/min高速離心10 min，上清液進(jìn)行液相處理。色譜檢測條件為225 nm，進(jìn)樣量20μL，流速 0.5 mL/min，流動相選用V（磷酸二氫鉀（pH 3.5））∶V（甲醇）=38∶62[6]。

2）青霉素鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 青霉素鈉溶液的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度曲線：用降解培養(yǎng)基作為溶劑配置不同質(zhì)量濃度的青霉素鈉溶液并作3個(gè)平行樣，在相同色譜條件下進(jìn)樣，以青霉素鈉質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)繪制青霉素鈉質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 接種體積分?jǐn)?shù)對降解效率的影響 在含有青霉素鈉終質(zhì)量濃度為10 g/L的降解培養(yǎng)基中分別接種體積分?jǐn)?shù)1%、5%、10%、15%、20%、30%的菌液，于30℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，取24 h的菌液進(jìn)行液相色譜分析。

1.3.5 青霉素鈉的初始質(zhì)量濃度對降解效率的影響 在已知最佳菌株接種體積分?jǐn)?shù)的降解培養(yǎng)基中，加入終質(zhì)量濃度分別為 5、10、15、20、30、40 g/L的青霉素鈉，于30℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，取24 h的菌液進(jìn)行液相色譜分析。

1.3.6 培養(yǎng)時(shí)間對降解效率的影響 確定出菌株的最佳接種體積分?jǐn)?shù)和青霉素鈉的初始質(zhì)量濃度后，在該條件于30℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，分別取12、24、36、48、60、72、84 h 的菌液進(jìn)行分析，探究培養(yǎng)時(shí)間對降解效率的影響。

1.3.7 Anti-Pen20降解青霉素鈉的產(chǎn)物分析 取菌株在降解培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，確定菌株降解青霉素鈉的產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌株的初步鑒定結(jié)果 將土壤樣品中的菌株涂布在含有質(zhì)量濃度為5 g/L青霉素鈉的LBG培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后挑選出8株耐藥菌株，分別編號為J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7、J8， 通過劃線分離純化再逐步提高培養(yǎng)基中青霉素鈉的質(zhì)量濃度至30 g/L，以及后期對各菌株降解青霉素鈉效率的比較，最終在青霉素鈉的質(zhì)量濃度為20 g/L的LBG培養(yǎng)基上挑選出一株生長良好的青霉素鈉高效降解菌株J4，命名為Anti-Pen20。對Anti-Pen20的劃線分離結(jié)果見圖1（a）。在LBG固體培養(yǎng)基上菌落呈橙紅色且具有光澤，圓形，邊緣光滑，易挑起。從電鏡圖片1（b）中可以看到菌株Anti-Pen20為橢圓形，無鞭毛，菌體表面光滑，有出芽現(xiàn)象，菌體長5μm，寬3μm左右。

圖1 菌株Anti-Pen20的菌落特征及電鏡掃描圖Fig.1 Colony characteristics and electron microscope scans of strain Anti-Pen20

2.1.2 菌株的分子鑒定結(jié)果 經(jīng)初步的生理生化鑒定菌株Anti-Pen20為酵母菌屬，采用康為世紀(jì)酵母基因組DNA提取試劑盒提取Anti-Pen20的全基因組，通過PCR擴(kuò)增獲得菌株的18S rRNA基因的目的片段，由瓊脂糖凝膠電泳顯示片段的大小約為700 bp左右，見圖2。對PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示，菌株Anti-Pen20的18S rRNA長度為621 bp，其序列如下：

圖2 18S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of 18S rRNA

將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)菌株Anti-Pen20 與粘質(zhì)紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的序列同源性在99%以上，通過MEGA7軟件中的Neighbor-Joining分析方法構(gòu)建出菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹圖[7-8]，見圖3。菌株Anti-Pen20已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心 （China Center for Type Culture Collection，簡稱 CCTCC），菌種保藏登記號為：CCTCC M 2018202。

目前部分關(guān)于粘質(zhì)紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的研究表明，粘質(zhì)紅酵母表現(xiàn)出良好的拮抗酵母特性，其能在水果表皮上生長而對由病菌引起的水果病變表現(xiàn)出顯著的拮抗效果[9-10]，可以控制并降解水果及其制品中的展青霉素[11]。另有報(bào)道表明，粘質(zhì)紅酵母可通過添加至魚類、家禽類的養(yǎng)殖飼料中來增強(qiáng)養(yǎng)殖動物的抗病性，提高產(chǎn)品質(zhì)量[12-13]。

2.2 菌株Anti-Pen20的生長曲線

圖4為菌株Anti-Pen20在降解培養(yǎng)基中的生長曲線圖，生長溫度為30℃，pH 7.0，恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速100 r/min。由圖4可以看出，Anti-Pen20在前8個(gè)小時(shí)內(nèi)生長較慢，培養(yǎng)的第8～16小時(shí)為菌株的生長對數(shù)期，在培養(yǎng)20 h后進(jìn)入了生長穩(wěn)定期。

圖3 菌株Anti-Pen20的系統(tǒng)發(fā)育樹圖Fig.3 Phylogenetic tree of strain Anti-Pen20

圖4 Anti-Pen20的生長曲線圖Fig.4 Growth curve of Anti-Pen20

2.3 接種體積分?jǐn)?shù)對降解效率的影響

在培養(yǎng)基中青霉素鈉初始質(zhì)量濃度為10 g/L、30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h的條件下，不同接種體積分?jǐn)?shù)Anti-Pen20菌液的青霉素鈉降解率見圖5。從圖5可知，青霉素降解率在接種體積分?jǐn)?shù)為1%～15%區(qū)間逐步上升，但在接種體積分?jǐn)?shù)超過15%時(shí)，降解率顯著降低，因此菌株Anti-Pen20降解青霉素鈉的最佳接種體積分?jǐn)?shù)為15%。

2.4 青霉素鈉的初始濃度對降解效率的影響

在確定接種體積分?jǐn)?shù)為15%的條件下，向培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的青霉素鈉溶液，在30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，得到的降解結(jié)果見圖6。從圖6可知，在測試的青霉素鈉質(zhì)量濃度為5～20 g/L范圍內(nèi)，菌株Anti-Pen20對青霉素鈉的降解率都保持較高水平，其中青霉素鈉質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)的降解率達(dá)到85%。然而，但青霉素鈉質(zhì)量濃度大于20 g/L時(shí)，降解率顯著下降，其原因可能是高質(zhì)量濃度的青霉素鈉溶液抑制了菌株的生長，從而影響青霉素鈉的降解。因此，確定菌株Anti-Pen20最佳青霉素鈉降解質(zhì)量濃度為20 g/L。

圖5 接種體積分?jǐn)?shù)對降解效率的影響Fig.5 Effect of inoculum size on degradation efficiency

圖6 青霉素鈉的初始質(zhì)量濃度對降解效率的影響Fig.6 Effect of initial concentration of penicillin sodium on degradation efficiency

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對青霉素鈉降解效率的影響

菌株Anti-Pen20在接種體積分?jǐn)?shù)為15%，青霉素鈉初始質(zhì)量濃度為20 g/L的條件下，在前24小時(shí)內(nèi)的降解青霉素鈉的速率較快，12 h時(shí)降解率可達(dá)41%，24 h降解率可達(dá)83%，而在24 h后青霉素鈉降解率雖然仍在增加，但降解速率顯著下降，見圖7，這可能與培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、代謝產(chǎn)物的的積累有關(guān)[15-16]。

2.6 菌株Anti-Pen20降解青霉素鈉的產(chǎn)物分析

將菌株Anti-Pen20在降解培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵液處理后進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，得到的質(zhì)譜圖見圖8。由物質(zhì)的質(zhì)荷比聯(lián)系物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)分析可知，產(chǎn)物中存在著青霉素的幾種標(biāo)志性降解產(chǎn)物，主要有青霉素噻唑酸及去羧青霉素噻唑酸，符合β-內(nèi)酰胺酶作用的降解產(chǎn)物，見表1[17]。

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對青霉素鈉降解率的影響Fig.7 Effectofculture time on penicillin sodium degradation rate

圖8 降解產(chǎn)物二級質(zhì)譜圖Fig.8 Secondary spectra of degradation products

表1 Anti-Pen20降解青霉素鈉的主要產(chǎn)物Table 1 Main degradation products of penicillin sodium

3 結(jié) 語

從青霉素鈉生產(chǎn)企業(yè)附近的土壤中篩選出一株具有青霉素鈉抗性的菌株Anti-Pen20，通過生理生化以及分子水平鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌與粘質(zhì)紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的序列同源性超過99%。通過高效液相色譜分析作圖，發(fā)現(xiàn)青霉素鈉在10 g/L范圍內(nèi)響應(yīng)峰的峰面積與青霉素鈉質(zhì)量濃度高度契合一級反應(yīng)動力學(xué)方程式y(tǒng)=244.21x+1.608 7，其中y表示液相色譜響應(yīng)峰面積，x表示青霉素鈉質(zhì)量濃度，R2=0.999 9。優(yōu)化降解條件后發(fā)現(xiàn)，Anti-Pen20降解青霉素鈉的最佳接種體積分?jǐn)?shù)為15%，青霉素鈉的最佳質(zhì)量濃度為20 g/L，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌株對青霉素鈉降解效率逐漸降低。通過對Anti-Pen20降解青霉素鈉的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中主要有青霉素噻唑酸及去羧青霉素噻唑等。

Anti-Pen20所具有的高效降解青霉素鈉的能力以及粘質(zhì)紅酵母本身的特性，有望應(yīng)用于具有高質(zhì)量濃度青霉素鈉菌渣的處理回收，也可以為Anti-Pen20在動物飼料添加劑以及果業(yè)中作為防病變添加劑的應(yīng)用提供研究依據(jù)。