俞建峰 ， 夏曉露 ， 陳 健 ， 張楚唯 ， 榮家偉

（1.江南大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇省食品先進(jìn)制造裝備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

在食品工業(yè)生中，生鮮水果、蔬菜、魚(yú)類(lèi)和肉類(lèi)的保存十分重要。一方面是因?yàn)檫@些食物是人們?nèi)粘ｏ嬍车闹匾M成部分，其需求量巨大；另一方面是其含有大量的營(yíng)養(yǎng)元素和水分，因而容易受到微生物的污染[1-2]。在目前市場(chǎng)上的生鮮食品最常用的保存方式是冷藏或者冷凍，該方式能夠降低微生物的細(xì)胞活性、抑制其生長(zhǎng)速率，但并不能夠達(dá)到殺死微生物[3]。此外，一些嗜冷菌在冷藏或冷凍的低溫下仍然可以生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致食品被污染，嚴(yán)重威脅公眾安全[4]。因此，應(yīng)采用新型抗菌技術(shù)與冷藏相結(jié)合，有效控制生鮮食品上的食源性微生物，同時(shí)保證其營(yíng)養(yǎng)和品質(zhì)不被破壞。

可見(jiàn)光發(fā)光二極管（LED）技術(shù)由于其具備良好的抗菌作用，在食品加工行業(yè)備受關(guān)注，且有望成為新型食品保鮮技術(shù)。Srimagal[5]等研究了藍(lán)色發(fā)光二極管（LED）光照處理對(duì)于牛奶中大腸桿菌的滅活影響，結(jié)果表明經(jīng)LED藍(lán)光照射處理后的牛奶，與未接受藍(lán)光照射的牛奶相比，其物理性質(zhì)沒(méi)有顯著變化，但保質(zhì)期延長(zhǎng)了兩倍。Karen[6]等研究了在高鹽度環(huán)境和強(qiáng)酸環(huán)境下，405 nm發(fā)光二極管（LED）對(duì)于大腸桿菌和單核細(xì)胞李斯特菌的滅活影響，結(jié)果表明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽環(huán)境（15%NaCl）能夠顯著增強(qiáng)大腸桿菌和單核細(xì)胞李斯特菌對(duì)于405 nm LED的敏感性。在強(qiáng)酸環(huán)境（pH 3）下，使所有大腸桿菌和單核細(xì)胞李斯特菌完全滅活所需的光照劑量?jī)H為對(duì)照組（pH 7）的50%。Vinayak[7]等研究了在不同的輻照強(qiáng)度和溫度下，460 nm發(fā)光二極管（LED）對(duì)于鮮切菠蘿片表面沙門(mén)氏菌的滅活影響，結(jié)果表明溫度對(duì)于沙門(mén)氏菌的光照滅活影響顯著，而輻照強(qiáng)度的變化對(duì)其影響不大。但不同波長(zhǎng)的LED可見(jiàn)光與不同質(zhì)量濃度有機(jī)酸相結(jié)合，對(duì)于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的滅活影響尚未見(jiàn)報(bào)道。作者研究了3種波長(zhǎng)的LED光源（紅光、綠光、藍(lán)光）在不同溫度下對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的滅活影響；檸檬酸、乳酸、蘋(píng)果酸3種有機(jī)酸在不同溫度下對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的滅活影響以及藍(lán)光與有機(jī)酸相結(jié)合，在不同溫度下對(duì)于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的滅活影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli）菌株和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株：江南大學(xué)生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；檸檬酸、乳酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；蘋(píng)果酸：生物試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉浸出粉3 g，氯化鈉5 g，pH 7.2，溶于1 000 mL去離子水中，121℃高壓蒸汽滅菌15 min，備用；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，瓊脂15 g，胰蛋白胨5 g，酵母浸出粉2.5 g，pH 7.2，溶于1 000 mL去離子水中，121℃高壓蒸汽滅菌15 min，備用；精密電子分析天平：AR1140型，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品；恒溫鼓風(fēng)烘干干燥箱：DHG-9076A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)：SJCJ-2FD型，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；手提式壓力蒸汽滅菌鍋：XFS-280型，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；恒溫生化培養(yǎng)箱：SPX-200型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；紅光LED燈：TDR-9型，深圳市我的照明燈飾有限公司產(chǎn)品；綠光LED燈：TDG-9型，深圳市我的照明燈飾有限公司產(chǎn)品；藍(lán)光LED燈：TDB-9型，深圳市我的照明燈飾有限公司產(chǎn)品；光生物輻射安全評(píng)價(jià)系統(tǒng)：WT210型，杭州浙大三色儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及菌液制備 在超凈工作臺(tái)中，將實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種采用平板劃線法接種到瓊脂培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)24～48 h，取生命力旺盛的單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，大腸桿菌37℃振蕩培養(yǎng)8～12 h，枯草芽孢桿菌37℃振蕩培養(yǎng)12～24 h。將活化后的菌液用無(wú)菌去離子水稀釋?zhuān)箲揖旱臐舛冗_(dá)到107CFU/mL，備用[8-9]。

圖1 LED光源相對(duì)光譜功率密度分布圖Fig.1 Distribution of relative spectral power density of LED light sources

圖2 LED光照系統(tǒng)截面示意圖Fig.2 Cross sectional diagram of the LED illumination system

1.2.2 LED光源與光照系統(tǒng) 紅光（630 nm）、綠光（525 nm）、藍(lán)光（455 nm）3種波長(zhǎng)的LED光源，功率均為9 W，光照直徑90 mm，經(jīng)光生物輻射安全評(píng)價(jià)系統(tǒng)測(cè)得光源的相對(duì)光譜功率密度分布圖見(jiàn)圖1。LED光源固定于燈架上，置于恒溫生化培養(yǎng)箱中，由恒溫生化培養(yǎng)箱中的內(nèi)接電源供電，含有懸菌液的培養(yǎng)皿 （D=60 mm）放置在光源的下方55 mm距離處，光照系統(tǒng)的截面示意圖見(jiàn)圖2。

1.2.3 不同波長(zhǎng)的LED可見(jiàn)光抗菌試驗(yàn) 在超凈工作臺(tái)上，取預(yù)先制備濃度為107CFU/mL的懸菌液1mL，于9 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，將這10 mL懸菌液盛放在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿位于LED光源正下方55 mm處。整個(gè)組件放在恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)，以確保能夠調(diào)節(jié)試驗(yàn)溫度 （12、25℃），12℃是模擬超市貨架低溫環(huán)境，25℃是模擬室溫環(huán)境。在試驗(yàn)過(guò)程中，采用黑紙板覆蓋培養(yǎng)箱的玻璃窗口，以最大化減少試驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)組采用不同波長(zhǎng)的LED光源（紅光、綠光、藍(lán)光），對(duì)照組去除LED光源，其他試驗(yàn)環(huán)境與實(shí)驗(yàn)組相同。在試驗(yàn)過(guò)程中，每間隔1小時(shí)取樣一次。

1.2.4 不同有機(jī)酸的抗菌試驗(yàn) 根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中的相關(guān)規(guī)定，本試驗(yàn)中乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸的最大添加量為1 g/kg。實(shí)驗(yàn)組取預(yù)先制備的濃度為107CFU/mL的懸菌液1 mL，于9 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，將這10 mL懸菌液盛放在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，再分別添加乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸使其最終質(zhì)量濃度均為1 g/kg，對(duì)照組加入等量的無(wú)菌去離子水。培養(yǎng)皿置于無(wú)光源的試驗(yàn)環(huán)境，分別在環(huán)境溫度為12℃和25℃的條件下，靜置8 h，每間隔1小時(shí)取樣一次。

1.2.5 LED藍(lán)光與有機(jī)酸的協(xié)同抗菌試驗(yàn) 選擇LED藍(lán)光與3種有機(jī)酸進(jìn)行協(xié)同抗菌試驗(yàn)。取預(yù)先制備的濃度為107CFU/mL的懸菌液1 mL，于9 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，將這10 mL懸菌液盛放在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，再分別添加檸檬酸、乳酸、蘋(píng)果酸使其最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1 g/kg，對(duì)照組加入等量的無(wú)菌去離子水。培養(yǎng)皿置于藍(lán)光光源正下方55 mm處，分別在環(huán)境溫度為12℃和25℃下光照處理8 h，每間隔1小時(shí)取樣1次。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)取樣點(diǎn)的活菌數(shù)量由平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)得到3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算平均值。采用SAS 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差及顯著性分析。以試驗(yàn)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以lg（CFU/mL）為縱坐標(biāo)繪制時(shí)間—菌落總數(shù)曲線[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同波長(zhǎng)的LED可見(jiàn)光抗菌結(jié)果

由圖3可知，在12℃的條件下，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在對(duì)照組中，活菌數(shù)始終在初始值附近上下波動(dòng)，變化不大，同時(shí)在接受LED光照處理后的變化趨勢(shì)也基本一致。對(duì)于大腸桿菌，在使用LED紅光、綠光、藍(lán)光照射8 h后，與對(duì)照組相比，活菌數(shù)分別降低了（0.08±0.03）lg（CFU/mL）、（0.35±0.06）lg（CFU/mL）、（0.94±0.04）lg（CFU/mL）。 對(duì)于枯草芽孢桿菌，在使用LED紅光、綠光、藍(lán)光照射8 h后，與對(duì)照組相比， 菌落數(shù)分別降低了 （0.02±0.01）lg（CFU/mL）、（0.25±0.05）lg（CFU/mL）、（0.46±0.05）lg（CFU/mL）。

由圖4可觀察到，在25℃試驗(yàn)環(huán)境下，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)活性較旺盛，在對(duì)照組中試驗(yàn)8 h后，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的數(shù)量分別達(dá)到（8.15±0.11）lg （CFU/mL）、（7.06±0.04）lg（CFU/mL）。就大腸桿菌而言，在接受LED紅光、綠光、藍(lán)光照射8 h后，與對(duì)照組相比，活菌數(shù)分別降低了（0.29±0.06）lg（CFU/mL）、（1.14±0.06）lg（CFU/mL）、（1.81±0.07）lg（CFU/mL）。就枯草芽孢桿菌而言，在使用LED紅光、綠光、藍(lán)光光照處理8 h后，與對(duì)照組相比，菌落數(shù)分別降低了（0.09±0.03）lg（CFU/mL）、（0.31±0.05）lg（CFU/mL）、（0.72±0.04）lg（CFU/mL）。

圖3 12℃下不同波長(zhǎng)LED可見(jiàn)光的抗菌效果Fig.3 Effects of visible light wavelength on antimicrobial activity at 12℃

圖4 25℃下不同波長(zhǎng)LED可見(jiàn)光的抗菌效果Fig.4 Effects of visible light wavelength on antimicrobial activity at 25℃

細(xì)菌細(xì)胞光動(dòng)力滅活的機(jī)理是：細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的光敏性物質(zhì)，在接受特定光譜照射之后，即可產(chǎn)生活性氧（ROS）。這些活性氧能夠引起細(xì)胞壁天然結(jié)構(gòu)的快速破壞，同時(shí)能夠與細(xì)胞中的重要成分如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生反應(yīng)，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11-12]。結(jié)合圖3-4可得出：一方面是無(wú)論在何種溫度環(huán)境下，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌對(duì)藍(lán)光的敏感性最強(qiáng)，綠光次之，紅光最弱。這可能的原因是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性光敏物質(zhì)主要吸收的是400～500 nm之間的可見(jiàn)光光譜，尤其是400～420 nm之間的區(qū)域更為顯著[13]。而本研究中藍(lán)光的波長(zhǎng)值為455 nm，最符合吸收條件，故細(xì)菌細(xì)胞對(duì)藍(lán)光最為敏感。另一方面是在兩種試驗(yàn)溫度下，大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）對(duì)于LED光照處理的敏感性均大于枯草芽孢桿菌（革蘭氏陽(yáng)性菌），這可能是由于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁較厚，由肽聚糖和磷壁酸形成脂多糖層，形成一個(gè)天然的保護(hù)屏障，可阻止細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等物質(zhì)的損失，因此細(xì)胞的光滅活反應(yīng)也得到了削弱[14-15]。蘇冰梅、王婷[16]等使用喹諾酮類(lèi)與磺胺類(lèi)藥物對(duì)枯草芽孢桿菌與大腸桿菌的聯(lián)合毒性研究中也得到相似的結(jié)果。

2.2 不同有機(jī)酸的抗菌結(jié)果

從圖5可以發(fā)現(xiàn)，12℃下3種有機(jī)酸對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有抗菌效果。由圖5（a）可知，乳酸在12℃下對(duì)大腸桿菌的抗菌效果最強(qiáng)，在試驗(yàn)8 h后，與對(duì)照組相比，活菌數(shù)降低了 （0.58±0.05）lg（CFU/mL）。而檸檬酸和蘋(píng)果酸的抗菌效果較弱，與對(duì)照組相比，活菌數(shù)分別降低了（0.24±0.02）lg（CFU/mL）、（0.17±0.03）lg（CFU/mL）。由圖5（b）可知，在12℃下試驗(yàn)8 h后，乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，枯草芽孢桿菌的減少量分別為 （0.27±0.02）lg（CFU/mL）、（0.10±0.02）lg（CFU/mL）、（0.03±0.01）lg（CFU/mL）。

圖5 12℃下不同有機(jī)酸的抗菌效果Fig.5 Effect of different organic acids on antibacterial activity at 12℃

由圖6可知，25℃下大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)速率較快。而3種有機(jī)酸對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌分別有不同效果的抑制作用。與空白對(duì)照組相比，檸檬酸、乳酸、蘋(píng)果酸使大腸桿菌的活菌數(shù)分別減少了（1.80±0.06）lg（CFU/mL）、（2.01±0.04）lg（CFU/mL）、（1.32±0.05）lg（CFU/mL），而使枯草芽孢桿菌減少的活菌數(shù)分別為（0.28±0.04）lg（CFU/mL）、（0.51±0.05）lg（CFU/mL）、（0.16±0.03）lg（CFU/mL）。

綜合圖5-6的試驗(yàn)結(jié)果得到，在兩種試驗(yàn)溫度下，3種有機(jī)酸對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有明顯的抗菌效果。有機(jī)酸可解離成氫離子和酸根離子，隨著氫離子的積累會(huì)使pH降低，而大腸桿菌和枯草芽孢桿菌適宜生存在中性環(huán)境下，故其正常的代謝活動(dòng)遭到破壞，因此有機(jī)酸可產(chǎn)生抗菌效果[17]。但有機(jī)酸的抗菌機(jī)理并不僅僅與氫離子的濃度有關(guān)，在本試驗(yàn)的3種有機(jī)酸中，乳酸的酸性較弱，但其抗菌效果最好。這可能是乳酸對(duì)于細(xì)胞膜的親脂性最強(qiáng)，而蘋(píng)果酸最弱。未解離的乳酸分子與細(xì)胞膜結(jié)合，引起細(xì)胞膜中的脂多糖的釋放，損害了細(xì)胞膜的完整性，最終達(dá)到更好的抗菌效果[18-19]。

圖6 25℃下不同有機(jī)酸的抗菌效果Fig.6 Effect of different organic acids on antibacterial activity at 25℃

2.3 不同有機(jī)酸與LED藍(lán)光的共同抗菌結(jié)果

從圖7可知，在12℃下3種有機(jī)酸均可顯著提升LED藍(lán)光對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗菌效果。與對(duì)照組相比，在LED藍(lán)光與檸檬酸、乳酸、蘋(píng)果酸協(xié)同抗菌的實(shí)驗(yàn)組中，大腸桿菌的活菌數(shù)分別減少了（3.30±0.11）lg（CFU/mL）、（4.17±0.04）lg（CFU/mL）、（0.75±0.10）lg（CFU/mL），而枯草芽孢桿菌減少的活菌數(shù)分別為（2.67±0.08）lg（CFU/mL）、（3.88±0.17）lg（CFU/mL）、（1.30±0.07）lg（CFU/mL）。

圖7 12℃下不同有機(jī)酸與LED藍(lán)光的協(xié)同抗菌效果Fig.7 Synergistic antimicrobial activities of LED blue light and different organic acids at 12℃

從圖8可知，在25℃下3種有機(jī)酸均可輔助LED藍(lán)光滅活大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。就大腸桿菌而言，再添加檸檬酸、乳酸、蘋(píng)果酸的實(shí)驗(yàn)組中，藍(lán)光照射8 h后，與對(duì)照組相比，活菌數(shù)分別降低了（3.57±0.11）lg （CFU/mL）、（4.99±0.07）lg（CFU/mL）、（1.28±0.08）lg（CFU/mL）。 就枯草芽孢桿菌而言，在添加檸檬酸、乳酸和蘋(píng)果酸的試驗(yàn)組中，與對(duì)照組相比，藍(lán)光照射8 h后菌落數(shù)分別降低了（1.73±0.06）lg（CFU/mL）、（3.12±0.09）lg（CFU/mL）、（0.63±0.05）lg（CFU/mL）。

綜合圖7-8可知，3種有機(jī)酸均可顯著增強(qiáng)藍(lán)光對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗菌效果，但乳酸對(duì)細(xì)菌細(xì)胞光滅活的輔助最強(qiáng)，檸檬酸稍弱，蘋(píng)果酸最差。有機(jī)酸與LED藍(lán)光相結(jié)合可增強(qiáng)抗菌效果的原因如下：一方面有機(jī)酸分子能夠擾亂細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，阻止DNA和RNA合成，改變細(xì)胞膜的通透性，削弱細(xì)胞的代謝活動(dòng)[20]；另一方面是未解離的有機(jī)酸分子作用于細(xì)胞外膜導(dǎo)致磷脂和脂蛋白大量釋放，同時(shí)這些物質(zhì)是細(xì)菌細(xì)胞在光照滅活期間作用的主要目標(biāo)[21]。因此，有機(jī)酸可顯著提高LED可見(jiàn)光對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗菌效果。

圖8 25℃下不同有機(jī)酸與LED藍(lán)光的協(xié)同抗菌效果Fig.8 Synergistic antimicrobial activities of LED blue light and different organic acids at 25℃

3 結(jié) 語(yǔ)

作者研究了LED可見(jiàn)光與3種常用有機(jī)酸的協(xié)同抗菌效果，在3種可見(jiàn)光中，藍(lán)光對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抗菌效果最優(yōu)；而在3種有機(jī)酸中，乳酸的抗菌效果最為理想。 在LED藍(lán)光與3種有機(jī)酸協(xié)同抗菌試驗(yàn)中，乳酸對(duì)細(xì)菌光滅活的輔助最大，檸檬酸次之，蘋(píng)果酸最小。大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，對(duì)于LED可見(jiàn)光與有機(jī)酸的協(xié)同抗菌趨勢(shì)基本一致，但大腸桿菌對(duì)光滅活更加敏感。作者探究了LED可見(jiàn)光波長(zhǎng)與有機(jī)酸的種類(lèi)對(duì)培養(yǎng)基懸浮狀態(tài)下大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗菌效果，接下來(lái)將考察LED可見(jiàn)光與有機(jī)酸對(duì)于真實(shí)食物基質(zhì)（蔬菜、水果、牛奶等）上食源性微生物的抗菌效果，以期為食品工業(yè)中的食品保鮮和貯藏，提供新的思路與方法。