李 敏， 李 瑤， 趙 魁， 王 鶴， 何永吉， 范曉軍*

（1.太原理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030024；2.太原市寧化府益源慶醋業(yè)有限公司，山西 太原 030000；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西 太原 030006）

食醋是使用含有淀粉、糖的物料或酒精，經(jīng)微生物發(fā)酵釀造或用食用醋酸調(diào)制而成的酸味調(diào)味品或食品。在亞洲國(guó)家，人們偏好使用溫和、有甜味的谷物醋來(lái)作為面條和壽司的主要調(diào)味料，而在歐洲和美洲人們喜愛(ài)食用以水果為原料生產(chǎn)的果醋[1-2]。食醋的主要成分除了醋酸外，還含有氨基酸、有機(jī)酸、糖類、維生素、礦物質(zhì)、醇類、酯類等營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味成分[3-5]。食醋的營(yíng)養(yǎng)成分和品質(zhì)與發(fā)酵過(guò)程中的微生物代謝密切相關(guān)[6-7]。近年來(lái)，我國(guó)食醋生產(chǎn)企業(yè)在夏季高溫氣候條件下時(shí)常出現(xiàn)微生物污染情況，且通常伴隨著成品醋返渾、發(fā)粘、脹氣等腐敗現(xiàn)象[8-11]，嚴(yán)重地影響著食醋的營(yíng)養(yǎng)成分和品質(zhì)。

為了深入了解食醋釀造過(guò)程中發(fā)生的高溫條件致腐機(jī)制，國(guó)內(nèi)一些高校、科研院所和企業(yè)對(duì)腐敗醋樣中污染微生物及營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了初步研究。中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院程池等通過(guò)使用PCRDGGE技術(shù)比較了正常醋樣和污染醋樣的微生物群落結(jié)構(gòu)，并在此基礎(chǔ)上對(duì)兩種醋樣的微生物進(jìn)行了分離純化和鑒定，得出了污染菌為耐酸乳桿菌的結(jié)論[12]。此外，武漢輕工大學(xué)周幗萍等通過(guò)顯微形態(tài)觀察與16S rRNA序列分析從變質(zhì)醋樣中鑒定出了頭狀葡萄球菌和少量解淀粉芽孢桿菌，該課題組通過(guò)電子舌測(cè)試得出變質(zhì)醋中酸度和咸度略有下降，苦味和鮮回味大幅降低，苦回味和澀回味減少等結(jié)論[13]。2017年曹晉宜等科研工作者對(duì)比分析了發(fā)粘食醋和正常食醋的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)、香氣成分，結(jié)果顯示發(fā)粘食醋中總酸、乳酸、乙醇含量明顯上升，而還原糖、總酯、糠醛含量明顯下降。該研究小組通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)與16S rDNA序列同源性分析方法，并結(jié)合微生物宏基因組分類測(cè)序方法得出了引起食醋發(fā)粘的微生物主要是牛痘乳桿菌的結(jié)論[14]。以上各研究結(jié)論并不一致，也未深入分析分離菌株的耐熱特性及原因，研究結(jié)論仍不能準(zhǔn)確地解釋食醋發(fā)酵生產(chǎn)中僅在高溫時(shí)節(jié)出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象，食醋釀造行業(yè)內(nèi)研究者亦難以從中獲得一致性指導(dǎo)建議。究其原因，腐敗變質(zhì)醋樣本數(shù)量、分離條件及可靠的分析測(cè)試平臺(tái)的選擇都會(huì)影響相關(guān)研究結(jié)果。

乳酸桿菌是一類能使糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的益生菌，在人體內(nèi)起著調(diào)節(jié)免疫功能的作用。乳酸桿菌存在廣泛，其最適生長(zhǎng)pH為5.5～6.0，但在pH 3.0～4.5的強(qiáng)酸性環(huán)境中仍能生存[15-19]，這與食醋釀造過(guò)程中醋酸發(fā)酵階段的酸性環(huán)境pH 3.5～4.5相一致[20]，但是乳酸桿菌對(duì)高溫耐受能力相對(duì)較弱，能夠耐受43℃以上高溫條件的乳酸桿菌更鮮有報(bào)道[21-22]。夏季高溫時(shí)節(jié)醋酸釀造過(guò)程中醋醅中心最高溫度可達(dá)48～50℃[23]，通常狀況下乳酸桿菌并不能耐受這樣的高溫條件[24]，因此對(duì)條件致腐分離株的耐高溫特性研究十分必要。此外，食醋釀造腐敗現(xiàn)象不僅發(fā)生在醋酸發(fā)酵階段，高溫條件下酒精發(fā)酵階段也偶有發(fā)生，對(duì)篩選菌株的酒精耐受研究亦不容忽視。

在本研究中，課題組從5個(gè)不同批次的腐敗醋樣中分離獲得了46株細(xì)菌及4個(gè)穩(wěn)定菌群，其中編號(hào)為T(mén)YF-LIM-L09的菌群在多種培養(yǎng)條件下均表現(xiàn)出明顯的產(chǎn)氣現(xiàn)象，因此對(duì)其進(jìn)行了微生物宏基因組分類測(cè)序，并分析了該菌群的生長(zhǎng)特征、溫度和乙醇耐受、產(chǎn)氣能力及關(guān)鍵酶活性特征，以期對(duì)食醋釀造高溫條件致腐微生物有更全面、深入的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 5個(gè)不同批次的腐敗醋樣中分離獲得46株細(xì)菌及4個(gè)菌群；大腸桿菌BL21、地衣芽孢桿菌PWD-1為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.1.2 MRS培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨 10，牛肉粉 8，酵母粉4，葡萄糖20，磷酸二氫鉀2，檸檬酸氫二銨2，無(wú)水乙酸鈉5，硫酸鎂 0.58，硫酸錳 0.19，瓊脂 14；吐溫-80 1 mL，115℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑 蛋白胨、酵母粉：英國(guó)OXOID公司；牛肉粉、檸檬酸氫二銨、葡萄糖、吐溫-80：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；乙酸鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸錳、無(wú)水乙醇、糠醛：均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉、氨芐青霉素、溴化乙錠、27F、1492R通用引物、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （Diphosphopyridine nucleotide，NAD+）：生工生物工程 （上海）股份有限公司；Taq DNA聚合酶、10×Taq緩沖液、dNTP、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；瓊脂糖：美國(guó)invitrogen公司；DNA Marker：北京全式金公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒：BIOBASIC公司；丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）測(cè)定試劑盒：上海索萊寶生物科技有限公司；CO2氣體檢測(cè)管：北京北科綠洲安全環(huán)境科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Alphalmager HP型凝膠成像分析儀：美國(guó)proteinsimple公司；Multiskan GO型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)賽默飛世爾公司；Mastercycler pro S型PCR儀：艾本德中國(guó)有限公司；BT 124S型電子天平：德國(guó)賽多利斯股份公司；PB-10型pH計(jì)：德國(guó)賽多利斯股份公司；YXQ-LS-30S2型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DYCZ-24DN型迷你水平電泳：北京市六一儀器廠；JY 92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；DHACA型大容量振蕩器：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；HC-3018型高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中桂科學(xué)儀器有限公司；DYY-10C型電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 腐敗微生物的分離與鑒定 取10 mL腐敗成品醋離心濃縮至200 μL，涂布至MRS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48 h至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的菌落后，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并使用基因組提取試劑盒分別提取各分離菌的基因組。用通用引物27F、533R和1492R對(duì)單菌落進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast同源比對(duì)檢索，查找與被測(cè)菌種在16S rDNA序列相似性最高的物種。

1.3.2 菌群TYF-LIM-L09的宏基因分類測(cè)序分析取1 mL TYF-LIM-L09培養(yǎng)菌液，12 000 r/min離心1 min后，用細(xì)菌基因組抽提試劑盒提取沉淀中的細(xì)菌總DNA。用通用引物338F和806R擴(kuò)增細(xì)菌基因組16S的V3+V4區(qū)，擴(kuò)增引物序列參見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物建庫(kù)質(zhì)檢合格后，在Miseq高通量測(cè)序儀進(jìn)行PE 300 bp雙端測(cè)序。對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、拼接后，進(jìn)行OUT聚類分析，挑選相似度大于90%的序列歸為一類OTU，進(jìn)而對(duì)被測(cè)樣品中分屬不同OTUs的序列數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析樣品中對(duì)應(yīng)的菌群組成。

表1 細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增引物Table 1 16S rDNA PCR amplification primers of bacteria

1.3.3 菌群TYF-LIM-L09的溫度、乙醇及pH耐受特征 將TYF-LIM-L09菌液以2%的接種體積分?jǐn)?shù)接種到50 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，分別放置于設(shè)定溫度為 30、37、40、45、50 ℃，轉(zhuǎn)速為 200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)各培養(yǎng)物的OD600數(shù)值與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系。按照以上接種體積分?jǐn)?shù)，溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下，分別在初始pH 值為6.2±0.2，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 0%、2%、4%、6%、8%、10%的MRS液體培養(yǎng)基以及在不含乙醇，初始pH 值為 5.0、5.5、6.5、7.0、7.5 的 MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)TYF-LIM-L09，分別監(jiān)測(cè)各培養(yǎng)物的OD600數(shù)值與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系。

1.3.4 菌群TYF-LIM-L09的產(chǎn)氣檢測(cè)分析 將菌液以10%的接種體積分?jǐn)?shù)接種到50 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，封口放置于37℃、200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日使用CO2氣體檢測(cè)管檢測(cè)產(chǎn)氣量，大腸桿菌和地衣芽孢桿菌為對(duì)照菌。

按同樣的接種體積分?jǐn)?shù)分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為0%、2%、4%、6%、8%、10%的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)TYF-LIM-L09；另外分8個(gè)梯度在pH 4.0～7.5的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)強(qiáng)產(chǎn)氣菌TYF-LIML09，封口放置于37℃、200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日使用CO2氣體檢測(cè)管檢測(cè)產(chǎn)氣量，分析乙醇、pH值對(duì)TYF-LIM-L09產(chǎn)氣量的影響。

1.3.5 TYF-LIM-L09的關(guān)鍵酶活性測(cè)定 粗酶液的處理：待OD600值達(dá)到1.2時(shí)收集TYF-LIM-L09培養(yǎng)菌液，加入pH 7.4的PBS緩沖液后破碎菌體，離心取上清液獲得粗酶液。

1）丙酮酸激酶酶活測(cè)定 用試劑盒測(cè)定丙酮酸激酶活力，具體操作方法根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2）丙酮酸脫羧酶酶活測(cè)定 在200 μL體系中加入pH 6.0、100 mmol/L磷酸緩沖液，1 mol/L丙酮酸鈉溶液，6.4 mmol/L NADH，3.5 μL粗酶液， 在波長(zhǎng)340 nm處檢測(cè)反應(yīng)液5 min內(nèi)每分鐘吸光度值的變化。

3）醇脫氫酶酶活測(cè)定 在200 μL體系中加入pH 9.0、0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鉀緩沖液，0.1 mol/L 糠醛溶液，0.1 mol/L NADH，10 μL 粗酶液，在波長(zhǎng)340 nm處檢測(cè)反應(yīng)液5 min內(nèi)每分鐘吸光度值的變化。

酶活單位定義：1酶活單位（1U）等于每分鐘氧化 1 μmol NADH 生成 1 μmol NAD+的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 腐敗微生物的分離與鑒定

課題組選取了5個(gè)不同批次的腐敗醋樣，編號(hào)為 TYF、TYH、TYJ、TYK 和 TYM，相關(guān)理化指標(biāo)見(jiàn)圖1。將從以上腐敗醋樣中分離獲得的50株細(xì)菌的16S rDNA測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GENBANK做同源比對(duì)檢索，得出鑒定結(jié)果，具體見(jiàn)表2。分離獲得的菌株中44株菌來(lái)自8個(gè)已知屬，分別為魯梅利桿菌屬、腸球菌屬、漫游球菌屬、乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、短波單胞菌屬和類芽孢桿菌屬，另外2株分離菌株尚無(wú)已知定義屬。此外，在對(duì)分離到的單菌落進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)的結(jié)果顯示為套峰，說(shuō)明這4個(gè)單菌落在組成上可能形成了固定群落，因此根據(jù)其主峰僅對(duì)其進(jìn)行了屬歸類。

圖1 正常醋樣與腐敗醋樣的理化指標(biāo)Fig.1 Physicochemical indicators of normal and spoiled vinegar samples

表2 腐敗樣醋中分離菌株的16S rDNA BLAST序列分析結(jié)果Table 2 BLAST results of 16S rDNA sequences of selected bacteria from spoiled vinegar

續(xù)表2

2.2 菌群TYF-LIM-L09的強(qiáng)產(chǎn)氣現(xiàn)象與宏基因組分類測(cè)序分析結(jié)果

在培養(yǎng)TYF-LIM-L09的過(guò)程中觀察到了明顯的產(chǎn)氣現(xiàn)象，見(jiàn)圖2，據(jù)此推斷該菌為夏季高溫條件致腐關(guān)鍵微生物。但經(jīng)數(shù)次劃線分離培養(yǎng)后其16S rDNA PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果依舊顯示為套峰，推測(cè)其為穩(wěn)定的微生物群落，鑒于此，采用微生物宏基因組分類測(cè)序方法對(duì)其進(jìn)行了分析。分析結(jié)果顯示，TYF-LIM-L09確實(shí)為共生菌群，其中優(yōu)勢(shì)菌集中于厚壁菌門(mén)（50.4%）和變型菌門(mén)（17.57%），其中乳酸桿菌屬微生物最高達(dá)45.77%，見(jiàn)表3。

圖2 TYF-LIM-L09培養(yǎng)過(guò)程中的產(chǎn)氣現(xiàn)象Fig.2 Gas production of TYF-LIM-L09 during the cultivation process

表3 菌群TYF-LIM-L09宏基因組分類測(cè)序分析Table 3 Metagenomic analysis of bacterial consortium TYF-LIM-L09

2.3 菌群TYF-LIM-L09的溫度、乙醇及pH耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在研究溫度與TYF-LIM-L09生長(zhǎng)特征關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期50℃時(shí)菌體生長(zhǎng)最快，而30℃時(shí)培養(yǎng)10 h后菌體才開(kāi)始快速生長(zhǎng)；培養(yǎng)20 h后45℃生長(zhǎng)的菌體OD值最大，說(shuō)明該溫度條件下生物量積累最高，見(jiàn)圖3。TYF-LIM-L09對(duì)乙醇的耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)基中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增高，菌體的生長(zhǎng)受到更大程度的抑制。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，菌體生長(zhǎng)與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化；4%和6%時(shí)菌體生長(zhǎng)速率明顯降低，體積分?jǐn)?shù)達(dá)8%時(shí)菌體的最大OD值為0.868，是對(duì)照組的46.1%，乙醇體積分?jǐn)?shù)10%時(shí)TYF-LIM-L09無(wú)生長(zhǎng)現(xiàn)象。綜合該菌對(duì)乙醇的耐受特征，其能耐受的乙醇體積分?jǐn)?shù)可高達(dá)8%，具有很好的酒精耐受能力[25]。隨著培養(yǎng)基pH值降低，菌體的生長(zhǎng)受到不同程度的影響，其中在pH 5.5的培養(yǎng)基中，菌體在培養(yǎng)8 h后才開(kāi)始生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率與pH≥6.0的培養(yǎng)基相比生長(zhǎng)緩慢。在pH 5.0的培養(yǎng)基中未檢測(cè)到菌體生長(zhǎng)，說(shuō)明該菌能耐受的pH值為5.5。

圖3 在不同溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)以及pH培養(yǎng)條件下TYF-LIM-L09的生長(zhǎng)特征Fig.3 Growth characteristics of TYF-LIM-L09 under different temperatures，alcohol concentrations and pH values

2.4 TYF-LIM-L09的產(chǎn)氣檢測(cè)分析

在 37 ℃、pH 6.2±0.2、200 r/min的條件下使用MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)TYF-LIM-L09、大腸桿菌BL21、地衣芽孢桿菌PWD-1，24 h后檢測(cè)產(chǎn)氣量。TYF-LIM-L09產(chǎn)氣現(xiàn)象十分突出，經(jīng)檢測(cè)產(chǎn)生的氣體為CO2，體積分?jǐn)?shù)高達(dá)71.43%；而大腸桿菌BL21、地衣芽孢桿菌PWD-1產(chǎn)生的CO2體積分?jǐn)?shù)分別為0.41%和0.50%。

在 pH 6.2±0.2、37 ℃、200 r/min的條件下檢測(cè)培養(yǎng)基中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)生CO2的影響，見(jiàn)圖4（a）。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)基中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，TYF-LIM-L09的CO2產(chǎn)出量逐漸降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%或更高時(shí)，幾乎沒(méi)有CO2產(chǎn)生。圖4（b）顯示了在37℃、200 r/min條件下，培養(yǎng)基初始pH值對(duì)TYF-LIM-L09產(chǎn)生CO2的影響。結(jié)果顯示，在pH 4.0～5.0條件下，培養(yǎng)物幾乎沒(méi)有CO2產(chǎn)生；pH 5.5～7.5時(shí)均有CO2產(chǎn)生并且pH 6.0時(shí)的產(chǎn)氣量最大。

2.5 TYF-LIM-L09的糖代謝關(guān)鍵酶活性

丙酮酸激酶、丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶是葡萄糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，與丙酮酸、CO2、乙酸、乙醇的生成密切相關(guān)[26]。由于在培養(yǎng)過(guò)程中TYF-LIML09表現(xiàn)出了較強(qiáng)的生產(chǎn)CO2的特性，因此使用粗酶液測(cè)定了TYF-LIM-L09的糖代謝關(guān)鍵酶活性，表4中數(shù)據(jù)從酶學(xué)方面驗(yàn)證了該菌群的糖代謝能力。

3 結(jié)語(yǔ)

課題組從5個(gè)不同批次的腐敗醋樣中分離獲得了來(lái)源于8個(gè)已知屬的44株細(xì)菌，2株未知屬的菌株及4個(gè)穩(wěn)定菌群。其中，乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬在相關(guān)研究中已經(jīng)報(bào)道過(guò)，而魯梅利桿菌屬、短波單胞菌屬、腸球菌屬、漫游球菌屬和類芽孢桿菌屬均是在本研究中首次分離獲得，說(shuō)明腐敗醋樣本數(shù)量以及樣本的釀造工藝來(lái)源對(duì)條件致腐微生物的分離和篩選有著重要的影響。

圖4 TYF-LIM-L09在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)以及不同pH的培養(yǎng)條件下產(chǎn)氣量的變化情況Fig.4 Gas production by TYF-LIM-L09 under different alcohol concentrations and pH values

表4 TYF-LIM-L09粗酶液的丙酮酸激酶、丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶活性Table 4 Activities of pyruvate kinase，pyruvate decarboxylase，alcohol dehydrogenase in the cell-free supernatant of TYF-LIM-L09

本研究就強(qiáng)產(chǎn)氣菌群TYF-LIM-L09的組成結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)特征進(jìn)行了深入研究，首次發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致脹氣的關(guān)鍵微生物以穩(wěn)定的群落形式存在，這也從另一方面解釋了前期相關(guān)研究中對(duì)食醋釀造條件致腐微生物鑒定結(jié)果不一致的問(wèn)題。課題組在TYF-LIM-L09的分離過(guò)程中使用了不同的選擇性培養(yǎng)基，進(jìn)行了多輪次劃線分離，但單菌落的16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果始終為套峰，所以判斷其為共生菌群，并對(duì)TYF-LIM-L09進(jìn)行了宏基因組分類測(cè)序分析，分析結(jié)果也驗(yàn)證了之前的判斷。TYF-LIM-L09的宏基因組分類測(cè)序分析結(jié)果顯示，其由乳酸桿菌屬、假單胞菌屬、短波單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬、金黃色葡萄球菌屬等不同種屬的微生物組成，這當(dāng)中就含有前期研究中報(bào)道較多的乳酸桿菌屬和芽孢桿菌屬[27]。分析結(jié)果表明，條件致腐微生物的耐高溫性質(zhì)可能與其組成結(jié)構(gòu)有關(guān)，同時(shí)也很好地解釋了前期研究中分離獲得的乳酸桿菌與致腐微生物耐高溫特性之間的矛盾。

食醋釀造高溫腐敗現(xiàn)象雖然多發(fā)生在醋酸發(fā)酵階段，但在低濃度酒精發(fā)酵階段也偶有發(fā)生，且腐敗的成品醋多伴隨著拉絲、脹氣等變質(zhì)現(xiàn)象。結(jié)合食醋高溫腐敗現(xiàn)象特征，作者對(duì)TYF-LIM-L09的溫度、乙醇、pH耐受及產(chǎn)氣特征做了系統(tǒng)的研究，該菌群表現(xiàn)出了很好的乙醇耐受和產(chǎn)氣能力，研究結(jié)果很好地支持了TYF-LIM-L09為引起食醋腐敗的關(guān)鍵微生物。

隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)引起食醋釀造高溫腐敗現(xiàn)象的微生物組成較為復(fù)雜，這些不同種群來(lái)源的微生物在營(yíng)養(yǎng)代謝方面相互依賴、互為補(bǔ)充，形成了穩(wěn)定的共生體系。探索研究核心致腐微生物菌群營(yíng)養(yǎng)代謝特征的有效方法有利于揭示食醋釀造高溫條件致腐現(xiàn)象的本質(zhì)，對(duì)解決食醋釀造高溫腐敗問(wèn)題也有著重要意義。