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針灸對CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期的影響*

2020-06-19 06:50:52劉海偉
針灸臨床雜志 2020年4期
關(guān)鍵詞:百分率骨髓基質(zhì)

劉海偉,路 玫

(1.甘肅省中醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450008)

烷化劑環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)是臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤化療藥物和免疫抑制藥物,使用后的反復(fù)毒性作用可造成骨髓造血微環(huán)境的損害[1],并呈現(xiàn)不可逆的改變。骨髓造血微環(huán)境是造血干細(xì)胞賴以增殖、分化、成熟的“土壤”。造血微環(huán)境主要由基質(zhì)細(xì)胞(stromal cells)、細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)和造血生長因子(hematopoietic growth factor)組成。其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone marrow stromal cell,BMSC)是造血微環(huán)境的重要組成成分。通過產(chǎn)生并分泌細(xì)胞黏附分子及造血因子,調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的歸巢、定位、增殖、分化、成熟、遷移、凋亡[2]。化療后造血微環(huán)境的損傷主要表現(xiàn)在骨髓基質(zhì)細(xì)胞多種粘附分子表達(dá)降低和粘附能力下降,嚴(yán)重影響著造血細(xì)胞的分裂增殖。本課題組前期研究證實(shí),針灸可以促進(jìn)化療后骨髓細(xì)胞的抗損傷和修復(fù)功能,加速骨髓細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)細(xì)胞DNA的合成,保護(hù)骨髓細(xì)胞,使CTX的骨髓抑制狀態(tài)得到改善[3]。本實(shí)驗(yàn)研究利用CTX建立小鼠骨髓抑制模型,通過觀察針灸對CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)細(xì)胞周期變化的影響,探討針灸對抗化療毒副反應(yīng)、改善骨髓造血微環(huán)境中BMSC細(xì)胞周期變化、促進(jìn)造血功能重建的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

選用SPF級雄性昆明種小鼠40只,由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供,動物合格證號:scxk(豫)2014-0001,體質(zhì)量(22±2)g。實(shí)驗(yàn)動物購回后,在相對濕度60%、溫度20~25℃的清潔級實(shí)驗(yàn)室中,自由喂養(yǎng)3 d,小鼠稱重后,依據(jù)體質(zhì)量按照隨機(jī)分層分組的方法,分籠飼養(yǎng),每籠5只。分別為空白組、模型組、針刺組、艾灸組,每組10只。用苦味酸溶液對各組小鼠進(jìn)行染色編號。

1.2 主要試劑

環(huán)磷酰胺(0.12 g/瓶,山西普德藥業(yè)有限公司,批號:20070303);4%多聚甲醛固定液(上海歌凡生物有限公司,批號:20140204);10%EDTA脫鈣液(青島捷世康生物科技有限公司,批號:20140713);凱基細(xì)胞DNA含量檢測試劑盒(細(xì)胞周期,南京生物科技有限公司,產(chǎn)品編號:KGA511-KGA512);HRP辣根過氧化物酶,中性樹膠封片劑;PBS緩沖液;70%乙醇。

1.3 儀器及材料

低速離心機(jī)(江蘇太倉醫(yī)療器械廠);COULTER EPICS-XL型流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司);-80℃低溫冰箱(河南新鄉(xiāng)新飛公司);生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司);薄片離心機(jī)SHANDON(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(江蘇醫(yī)療器械廠);pH儀(PHS-25型,上海醫(yī)療器械廠);8112型磁力恒溫攪拌器(上??h曹行無線電廠);電熱干燥箱;孵育盒;MicromHM 340E石蠟切片機(jī);37℃恒溫水箱;200目篩網(wǎng);細(xì)胞計數(shù)板等。

1.4 造模方法

依據(jù)《新藥(西藥)臨床研究指導(dǎo)原則匯編》[4]的模型制作方法,模型組、針刺組、艾灸組分別采用環(huán)磷酰胺(CTX)建立骨髓抑制小鼠模型。腹腔注射CTX100 mg/kg/d(按照小鼠體質(zhì)量0.02 mL/g用藥量,注射濃度為5 mg/mL的CTX溶液),后分別在24 h、48 h再行CTX注射,即連續(xù)3 d。停藥后4 h模型制作成功(依據(jù)環(huán)磷酰胺藥代動力學(xué)過程,4 h后藥物活性消失[5])??瞻捉M給予注射同等劑量的生理鹽水,連續(xù)3 d。

1.5 固定小鼠

右手食指、拇指捏住小鼠尾巴,將小鼠置于鼠籠蓋上,小鼠向前爬時,用左手大拇指和食指內(nèi)側(cè)面捏住小鼠頭頸部皮膚以固定小鼠,用無名指和小指配合大魚際共同固定小鼠尾骶部及尾巴,然后用力量大小適宜的塑料夾子(布條纏繞其夾口,以防止對小鼠四肢造成損傷),夾住小鼠四肢后,將小鼠俯臥位固定于預(yù)先備好的鼠板上。

1.6 干預(yù)方法

選取“大椎”“膈俞”“腎俞”“足三里”。小鼠穴位定位依據(jù)《中國獸醫(yī)針灸學(xué)》[6],并模擬大鼠定位方法,具體定位為“大椎”位于背中線上,第7頸椎與第1胸椎棘突間;“膈俞”位于第7胸椎棘突下,左右各1穴;“腎俞”在第2腰椎棘突下,左右各1穴;“足三里”位于小鼠后肢膝關(guān)節(jié)下外側(cè),腓骨小頭下3.5 mm處取穴,左右各1穴。

1.6.1 針刺組 采用華佗牌美容毫針(規(guī)格:0.19 mm×10.00 mm,由蘇州醫(yī)療器械用品有限公司制作),采用快速進(jìn)針法直刺,進(jìn)針深度為3 mm,行捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法1次,留針6 min。每天1次,連續(xù)5 d。

1.6.2 艾灸組 用特制美容細(xì)艾條(規(guī)格:0.4 cm×25 cm,由河南南陽臥龍艾絨廠制作)點(diǎn)燃后,在距離穴位皮膚5 mm處每穴固定懸灸3 min。每天1次,連續(xù)5 d。

1.6.3 空白組、模型組 每天陪同針刺組、艾灸組抓取、固定,不做任何治療。

1.7 觀察指標(biāo)及方法

依次從治療后第1天、第3天、第5天,觀察各組小鼠骨髓造血微環(huán)境中BMSC細(xì)胞周期百分率的變化。

1.7.1 小鼠骨髓石蠟包埋塊制作 將預(yù)先用4%多聚甲醛固定好的左側(cè)小鼠股骨,采用10%EDTA脫鈣液脫鈣1周,脫鈣成功后,依次采用全自動脫水機(jī)按如下步驟和時間進(jìn)行脫水:70%乙醇2 h;80%乙醇2 h;90%乙醇2 h;95%乙醇Ⅰ2 h;95%乙醇Ⅱ 2 h;無水乙醇Ⅰ 1 h;無水乙醇Ⅱ 1 h。然后分別二甲苯Ⅰ 30 min;二甲苯Ⅱ 30 min進(jìn)行透明。經(jīng)過透明處理后,應(yīng)用石蠟Ⅰ(50~52℃)60 min;石蠟Ⅱ(60~62℃)60 min浸蠟處理。經(jīng)過浸蠟后應(yīng)用全自動包埋儀進(jìn)行蠟塊包埋。包埋好的蠟塊置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液制備 具體制備步驟為:切片機(jī)上切取整塊石蠟包埋組織塊,將其切為3~5片,厚度為40~50 μm,而后全部置于試管中;在室溫下加入二甲苯5 mL脫蠟,依據(jù)脫蠟程度,可置換1次二甲苯,待石蠟脫凈后,棄除二甲苯;依次分別加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5 mL進(jìn)行水化,每步10 min,后棄乙醇,加入蒸餾水5 mL,5 min后棄去;后加入0.5%胃蛋白酶消化液5 mL,置于37℃恒溫水箱中消化30 min,期間每隔10 min震蕩1次;消化30 min,加入生理鹽水終止消化;采用300目尼龍網(wǎng)過濾,消化未徹底的可進(jìn)行2次消化;收集細(xì)胞懸液,依據(jù)1 500 r/min離心沉淀,后經(jīng)生理鹽水漂洗2次,500~800 r/min離心沉淀,去除參與碎片,制備好的細(xì)胞懸液,應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)板技術(shù),制作成1×106/mL的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)單細(xì)胞懸液,置于4℃冰箱保存待測。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測

應(yīng)用凱基細(xì)胞周期DNA含量檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供,產(chǎn)品批號:KGA511-KGA512),具體操作步驟為:將用PBS洗滌過的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC),采用2 000 r/min轉(zhuǎn)速,離心5 min制備單細(xì)胞懸液,其細(xì)胞濃度為1×106/mL,取1 mL單細(xì)胞懸液;將制備的單細(xì)胞懸液離心后,去除上清,在細(xì)胞中加入體積分?jǐn)?shù)為70%冷乙醇500 μL固定2 h,4℃保存,后用PBS洗去固定液;加入100 μL RNaseA37℃水浴30 min;再加入400 μL PI染液染色混勻,4℃避光30 min;上機(jī)檢測,每份標(biāo)本重復(fù)檢測3次,記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。用DNA MultiCycle軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)G1期細(xì)胞百分率比較

表1 各組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)G1期細(xì)胞百分率比較

注:與空白組比較,1)P<0.05,4)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.05,5)P<0.01;與針刺組比較,3)P<0.05。

如表1所示,模型組、針刺組、艾灸組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中BMSC的G1期細(xì)胞百分率變化趨勢大致相同。與空白組比較,模型組中的3 d組與5 d組BMSC的G1期細(xì)胞百分率明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,或P<0.01),見圖1;針刺組中1 d組BMSC的G1期細(xì)胞百分率明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,針刺組中的3 d組與5 d組BMSC的G1期細(xì)胞百分率明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05);與針刺組比較,艾灸組中的5 d組BMSC的G1期細(xì)胞百分率明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 空白組骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)分析圖

2.2 各組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)S期細(xì)胞百分率比較

表2 各組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)S期細(xì)胞百分率比較

注:與空白組比較,1)P<0.05,4)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.05;與針刺組比較,3)P<0.05。

如表2所示,與空白組比較,模型組中的1 d組與3 d組、5 d組BMSC的S期細(xì)胞百分率明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,針刺組3 d組BMSC的S期細(xì)胞百分率明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2;與針刺組比較,艾灸組5 d組BMSC的S期細(xì)胞百分率明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 模型組骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)分析圖

2.3 各組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)G2期細(xì)胞百分率比較

表3 各組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)G2期細(xì)胞百分率比較

注:與空白組比較,1)P<0.05,4)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.05,5)P<0.01;與針刺組比較,3)P<0.05。

如表3所示,與空白組比較,模型組中的1 d組、3 d組與5 d組BMSC的G2期細(xì)胞百分率明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,針刺組3 d組BMSC的G2期細(xì)胞百分率明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與針刺組比較,艾灸組3 d組BMSC的G2期細(xì)胞百分率明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3~4。

圖3 針刺組骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)分析圖

圖4 艾灸組骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)分析圖

3 討論

骨髓造血微環(huán)境又稱龕,可調(diào)節(jié)、定位造血干細(xì)胞[7],是造血干細(xì)胞(HSCs)的特化結(jié)構(gòu),其可駐留并調(diào)控HSCs,使之歸巢,造血微環(huán)境主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)及非細(xì)胞成分組成,骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)為其核心組成部分[8]?;熀罂梢砸鸸撬柙煅h(huán)境的嚴(yán)重破壞,同時也可以導(dǎo)致骨髓基質(zhì)細(xì)胞受損[9],出現(xiàn)骨髓造血功能障礙。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)周期變化是反應(yīng)骨髓造血微環(huán)境造血功能的主要指標(biāo)之一。細(xì)胞周期分為分裂間期和分裂期(M期),分裂間期分為G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)[10]。有研究證實(shí),骨髓細(xì)胞無法進(jìn)行正常有絲分裂,從而產(chǎn)生骨髓抑制[10]。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)并無“骨髓抑制”病名,依據(jù)該病的病因病機(jī)及臨床癥狀,可歸屬于中醫(yī)內(nèi)科學(xué)中“虛勞”范疇,病因多由機(jī)體正氣不足、復(fù)感外來化療之毒邪,導(dǎo)致氣血生化之源匱乏、肝腎精血不足,導(dǎo)致“毒邪”與氣血相互搏擊,使氣血臟腑功能失調(diào),發(fā)為本病。病機(jī)主要責(zé)之于氣血雙虧、腎精不足。依據(jù)“勞則溫之”“虛則補(bǔ)之”的治則,采用針刺和艾灸大椎、膈俞、腎俞、足三里,以達(dá)益氣健脾、調(diào)補(bǔ)氣血和培補(bǔ)后天之功。

本研究結(jié)果顯示,針灸可以減少CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)G1期細(xì)胞百分率,從而加速BMSC向S期的轉(zhuǎn)化。在針刺和艾灸治療3 d后,CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)S期細(xì)胞百分率均明顯升高,且高于空白組和模型組的水平,說明針刺和艾灸可以使CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)S期細(xì)胞百分率升高,S期為細(xì)胞DNA合成期,同時也佐證了采用針灸治療3 d后,對骨髓造血微環(huán)境中BMSC的DNA有修復(fù)和保護(hù)作用。但在采用針刺和艾灸治療5 d后,CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)S期細(xì)胞百分率呈下降趨勢,說明隨著治療時間的累積,針灸有減少骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)S期細(xì)胞百分率的作用,可加速骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)向G2期轉(zhuǎn)化。針灸可促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)G2期細(xì)胞百分率升高,

G2期為BMSC的DNA合成后期,說明針灸可促進(jìn)CTX化療后BMSC損傷后的自身修復(fù),加速BMSC的有絲分裂和增殖。同時可以使經(jīng)CTX化療受損的BMSC分裂停滯狀態(tài)得到修復(fù)。

烷化劑環(huán)磷酰胺(CTX)致骨髓造血微環(huán)境損傷后,干擾了骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)的細(xì)胞周期規(guī)律,使BMSC的DNA含量減少,使BMSC的細(xì)胞分裂停滯,從而產(chǎn)生骨髓抑制,導(dǎo)致骨髓造血功能障礙。采用本課題研究組抗化療穴組“大椎”“膈俞”“腎俞”“足三里”[11-12],可以使經(jīng)環(huán)磷酰胺(CTX)化療后骨髓造血微環(huán)境中的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)受損的細(xì)胞周期得到恢復(fù),可加速BMSC中G1期向S期、S期向G2期的轉(zhuǎn)化,促進(jìn)BMSC的受損DNA在S期大量合成、修復(fù),并可延長BMSC中G2期,使BMSC完成分裂與增殖,提高骨髓造血微環(huán)境中BMSC的修復(fù)能力,保護(hù)骨髓造血微環(huán)境,促進(jìn)骨髓造血功能的重建。

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