王春久，王 彤，楊 雪，舒 琦，郭長青

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是引起全球2.5億人關(guān)節(jié)紊亂的常見原因。中國膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率高達(dá)18%，女性較男性更易患KOA[1-2]。關(guān)節(jié)力學(xué)失穩(wěn)是KOA發(fā)病機(jī)制中的重要一環(huán)。韌帶作為力的承受和傳遞組織，主要參與維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定的靜力性系統(tǒng)。有學(xué)者證實(shí)在KOA動物模型中韌帶的力學(xué)性能改變可造成骨關(guān)節(jié)應(yīng)力變化，最終導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的退變[3-5]。韌帶具有粘彈性，其剛度越高關(guān)節(jié)穩(wěn)定性越大，研究表明運(yùn)用剪切波超聲彈性成像技術(shù)(SWE技術(shù))測量肌肉韌帶的彈性模量，能夠客觀評估其剛度等力學(xué)特性的變化，韌帶損傷后其超聲彈性模量值下降[6-7]。KOA發(fā)病時屈、伸肌群肌力均會下降，且女性的屈肌肌力下降幅度最大，與造成KOA的關(guān)節(jié)疼痛密切相關(guān)[8-9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)KOA模型兔伸肌肌力顯著下降，針刀干預(yù)伸肌后能有效改善肌肉、韌帶的力學(xué)性能，緩解軟骨基質(zhì)退變[3,10-11]，而目前以屈肌為干預(yù)手段的實(shí)驗(yàn)研究較少。故本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用SWE技術(shù)評估KOA兔內(nèi)側(cè)副韌帶(Medial collate-ral ligament，MCL)及外側(cè)副韌帶(Lateral collateral ligament，LCL)的超聲彈性模量，觀察針刀松解屈肌后對MCL、LCL力學(xué)性能的影響，為針刀治療KOA的力學(xué)效應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級6月齡新西蘭雄兔28只，購于北京科宇動物養(yǎng)殖中心，許可證號：SCXK(京)2018-0010，體質(zhì)量(3.0±0.5)kg。單籠、標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由攝食、水，室溫(22±2)℃，濕度40%～60%，定期紫外線消毒。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、針刀組、電針組共4組，每組7只，6只用于指標(biāo)檢測，1只用于驗(yàn)證造模。研究過程遵循中華人民共和國科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)意見》。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑與材料 戊巴比妥鈉(天津藥業(yè)焦作有限公司)；酒精(北京民生藥業(yè)有限公司)；4%多聚甲醛、蘇木素伊紅試劑、石蠟(北京化學(xué)試劑公司)；二甲苯(北京北化化學(xué)品有限責(zé)任公司);固寶牌樹脂繃帶(規(guī)格:15 cm×180 cm,珠海麗珠醫(yī)用生物材料有限公司)；高分子繃帶(規(guī)格:7.5 cm×360 cm,蘇州可耐特醫(yī)療科技有限公司)；一次性漢章系列超微針刀(規(guī)格:0.35 mm×25 mm,北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司)；一次性環(huán)球牌針灸針(規(guī)格:0.2 mm×13 mm,蘇州針灸用品有限公司)。

1.2.2 主要儀器 LH202H型韓式穴位神經(jīng)刺激儀(北京華為產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司)；EG1150型分體式包埋機(jī)(LYCRA)；半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)RM2245型(LYCRA)；Tissue-TEK VIP6生物組織脫水機(jī)(日本櫻花株式會社有限公司);HI1210型Leica撈片儀(LYCRA)；HI1220型烤片儀(LYCRA)；BX53型自動化智能型正置研究級顯微鏡(Olympus Corporation)； AixPlorer實(shí)時剪切波彈性成像超聲診斷儀(法國聲科影像公司);線陣探頭L10-2 mHz。

1.3 模型制備

采用改良Videman法固定制備KOA模型：造模前禁食10～16 h，3%戊巴比妥鈉以30 mg/kg劑量耳緣靜脈麻醉，起效后仰臥位固定于兔臺，樹脂繃帶于(75±10)℃熱水中浸泡軟化，牽拉伸直兔左后肢，脫脂棉墊于樹脂繃帶內(nèi)層，從腹股溝處用軟化后的樹脂繃帶固定至足趾，確保膝關(guān)節(jié)固定在180°、踝關(guān)節(jié)背屈60°位置，隨后以醫(yī)用紗布包繞樹脂繃帶，再外纏2層高分子繃帶，最外層以防啃咬繃帶包裹。模型組、針刀組、電針組3組均按上述方法造模，制動8周。8周后，隨機(jī)抽取正常組、模型組各1只兔，處死后取左后肢關(guān)節(jié)軟骨用HE光鏡觀察造模情況，成功后再拆除各組制動材料。

1.4 各組干預(yù)措施

1.4.1 正常組 正常飼養(yǎng)，不做干預(yù)，抓取、捆綁固定同干預(yù)組。

1.4.2 模型組 造模后正常飼養(yǎng)，不做干預(yù)，抓取、捆綁固定同干預(yù)組。

1.4.3 針刀組 制動解除1周后，每周治療1次，干預(yù)3周。在左后肢膝周針刀干預(yù)部位，龍膽紫定點(diǎn)，備皮消毒后，按針刀4步進(jìn)針規(guī)程刺入進(jìn)行松解，出針后按壓片刻止血。進(jìn)針點(diǎn)具體針刀操作：①半腱肌、半膜肌、股二頭肌肌腱止點(diǎn)針刀操作：松解肌腱移行處，術(shù)者左手拇指用力按壓，將軟組織緊緊按壓在骨面上，針刀刀刃平行于肌腱，刀體垂直皮膚切面刺入，向肌腱與骨連接方向松解3～5刀;②條索結(jié)節(jié)點(diǎn)：在膝周進(jìn)行循按觸摸，術(shù)者左手拇指按壓明顯的條索結(jié)節(jié)點(diǎn)，刀刃平行于條索結(jié)節(jié)縱軸，刀體垂直皮膚切面刺入，向條索結(jié)節(jié)的縱軸方向松解3～5刀。

1.4.4 電針組 制動解除1周后，隔天治療1次，干預(yù)3周。取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》《動物比較生理學(xué)》，并結(jié)合比較解剖取穴法、模擬骨度取穴法，電針左后肢“曲泉”“委陽”“內(nèi)膝眼”“外膝眼”腧穴，常規(guī)備皮、消毒，以毫針刺入上述穴位后，再以韓氏穴位神經(jīng)刺激儀分別連接“曲泉”“委陽”“內(nèi)膝眼”“外膝眼”，選用頻率2/100 Hz、疏密波型，強(qiáng)度3 mA，留針20 min。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.5.1 軟骨HE染色光鏡觀察 造模完成后，隨機(jī)抽取正常組、模型組各1只兔，處死后取左后肢關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，用生理鹽水沖洗后浸入4%多聚甲醛溶液，固定72 h。固定后浸入EDTA脫鈣液進(jìn)行脫鈣，然后脫水、透明、脫蠟、石蠟包埋，切片厚度6 μm，蘇木素-伊紅染色后，對兔膝關(guān)節(jié)軟骨情況進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.5.2 SWE檢測MCL、LCL的超聲彈性模量 治療結(jié)束1周后對各組兔進(jìn)行SWE檢測，采用法國聲科影像 AixPlorer型實(shí)時SWE超聲診斷儀對各組兔內(nèi)、外側(cè)副韌帶行在體彈性模量測量。檢測前備皮左后肢，備皮范圍由腹股溝至足踝，取仰臥位固定其余三肢于兔臺上，使左后肢處于最大伸直位，待兔安靜后檢測MCL、LCL的超聲彈性模量。首先探頭橫、縱切面探查MCL、LCL，進(jìn)行常規(guī)二維超聲檢查，縱軸切面內(nèi)選定感興趣區(qū)(ROI)，切換SWE模式，組織受聲輻射脈沖(Sonic Touch)刺激，超高速成像技術(shù)(UltraFAST)探測Sonic Touch產(chǎn)生的剪切波，形成組織彈性圖；凍結(jié)圖像，用Q-BOX功能測量韌帶超聲彈性模量，系統(tǒng)自動計算出Q-BOX區(qū)域內(nèi)韌帶的超聲彈性模量值(單位: KPa)，為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性以上超聲檢查由同一人完成。見封三彩圖1～2。

MCL、LCL的HE染色光鏡觀察：各組兔于干預(yù)結(jié)束1周后麻醉過量法處死，進(jìn)行取材，沿股骨內(nèi)上髁至脛骨內(nèi)側(cè)髁、股骨外上髁至腓骨頭外側(cè)面的皮膚切開，剝離皮下淺筋膜，暴露MCL、LCL后，取MCL、LCL中段約0.5 cm×0.3 cm×0.2 cm長作為光鏡觀察標(biāo)本，4℃下4%多聚甲醛固定48 h，固定后進(jìn)行脫水、透明、包蠟，切片厚度6 μm，HE染色光鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 軟骨HE染色光鏡觀察結(jié)果

2.1.1 正常組 軟骨表面平整光滑，細(xì)胞排列有序，胞體形態(tài)正常，細(xì)胞無簇集，無血管翳生成。見封三彩圖3。

2.1.2 模型組 軟骨表面粗糙、剝脫，細(xì)胞排列無序，胞體結(jié)構(gòu)破壞。見封三彩圖4。

2.2 SWE檢測MCL、LCL的超聲彈性模量結(jié)果

2.2.1 MCL的超聲彈性模量結(jié)果 與正常組比較，模型組MCL超聲彈性模量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針刀組、電針組MCL超聲彈性模量上升，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與電針組比較，針刀組MCL超聲彈性模量上升，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但上升趨勢更接近正常組。見表1。

表1 MCL的超聲彈性模量比較

注：與正常組比較，**P<0.05。

2.2.2 LCL的超聲彈性模量結(jié)果 與正常組比較，模型組LCL超聲彈性模量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針刀組、電針組LCL超聲彈性模量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與電針組比較，針刀組LCL超聲彈性模量上升，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但上升趨勢更接近正常組。見表2。

表2 LCL的超聲彈性模量比較

注：與正常組比較，**P<0.05；與模型組比較,▲P<0.05。

2.3 MCL、LCL的HE染色光鏡觀察結(jié)果

2.3.1 正常組 成纖維細(xì)胞核分布均勻、結(jié)構(gòu)完整呈橢圓形，膠原纖維排列有序。見封三彩圖5～6。

2.3.2 模型組 成纖維細(xì)胞核排列無序、數(shù)量明顯增多、胞核固縮，膠原纖維排列雜亂、甚至斷裂。見封三彩圖7～8。

2.3.3 針刀組 對比正常組，成纖維細(xì)胞核數(shù)量稍多、細(xì)胞核形態(tài)改變較小，膠原纖維排列較規(guī)則；對比模型組，胞核分布均勻、排列基本沿著膠原纖維的方向。見封三彩圖9～10。

2.3.4 電針組 對比正常組，成纖維細(xì)胞核數(shù)量稍密集、纖維排列較無序；對比模型組，胞核形態(tài)改變較小，纖維排列趨于規(guī)整，少數(shù)斷裂。見封三彩圖11～12。

與模型組比較，針刀及電針干預(yù)后，從組織形態(tài)學(xué)角度觀察KOA兔MCL、LCL都有不同程度的改善。與電針組比較，針刀組KOA兔MCL、LCL的成纖維細(xì)胞形態(tài)、膠原纖維排列更趨于正常組。說明針刀干預(yù)較電針對KOA兔內(nèi)、外側(cè)副韌帶的修復(fù)作用更佳。

3 討論

軟骨基質(zhì)降解是KOA重要病理標(biāo)志，近年來研究發(fā)現(xiàn)韌帶力學(xué)變化和軟骨基質(zhì)降解密切相關(guān)。韌帶屬粘彈性材料，是一種參與關(guān)節(jié)活動、維持關(guān)節(jié)穩(wěn)定性的重要力學(xué)組織，其硬度增強(qiáng)有利于維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，該特性會受到關(guān)節(jié)制動的影響[12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)制動后可導(dǎo)致MCL單位橫截面積內(nèi)合成的膠原纖維數(shù)量降低，基質(zhì)降解增加，韌帶生物力學(xué)特性的改變可造成骨關(guān)節(jié)應(yīng)力變化，最終導(dǎo)致KOA軟骨基質(zhì)的退變[3,13]。由此可知，韌帶的生物力學(xué)變化在KOA發(fā)展進(jìn)程中有重要的影響，那么改善韌帶力學(xué)性能或許可以成為治療KOA的新思路。

實(shí)時剪切波超聲彈性成像技術(shù)采用“馬赫錐”原理，追蹤組織中剪切波的傳播速度，通過UltraFAST技術(shù)、彩色編碼技術(shù)及Q-BOXTM定量分析系統(tǒng)測量組織的超聲彈性模量值。當(dāng)韌帶的力學(xué)性能發(fā)生變化后，可利用SWE技術(shù)追蹤韌帶組織中的剪切波傳播速度，獲得其超聲彈性模量值從而定量評估韌帶組織的硬度，超聲彈性模量與組織硬度呈正比，值越大說明組織硬度越高。張長杰等[13]研究發(fā)現(xiàn)，制動后模型組KOA兔膝周韌帶彈性模量值較正常組顯著下降。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，針刀干預(yù)伸肌即股四頭肌可有效改善KOA兔膝周韌帶的拉伸彈性模量，但以屈肌為主的干預(yù)尚未有相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)選取KOA兔腘繩肌即屈肌群止點(diǎn)處進(jìn)行干預(yù)，作為股四頭肌的拮抗肌，腘繩肌包括半腱半膜肌、股二頭肌，其在KOA疾病發(fā)展進(jìn)程中的作用不可忽視。研究發(fā)現(xiàn)，單純干預(yù)腘繩肌，可使大腿肌群力量增加，靜態(tài)及動態(tài)平衡能力隨腘繩肌力量增加而增強(qiáng)，以腘繩肌肌力訓(xùn)練為主的康復(fù)比以伸肌為主的訓(xùn)練康復(fù)更能改善KOA癥狀[14-15]。

SWE結(jié)果顯示，模型組KOA兔MCL、LCL的超聲彈性模量與正常組相比顯著下降，HE染色結(jié)果顯示MCL、LCL的成纖維細(xì)胞核排列無序、數(shù)量明顯增多、胞核固縮、膠原纖維排列雜亂甚至斷裂，說明KOA兔的韌帶力學(xué)效應(yīng)確有改變，組織結(jié)構(gòu)紊亂、硬度下降。針刀及電針干預(yù)后，MCL超聲彈性模量值升高，針刀組上升趨勢較電針組更明顯；LCL超聲彈性模量值升高，針刀組上升趨勢較電針組更明顯且較模型組顯著上升(P<0.05)。針刀組HE染色結(jié)果顯示對比正常組，成纖維細(xì)胞核數(shù)量稍多、細(xì)胞核形態(tài)改變較小，膠原纖維排列較規(guī)則，對比模型組，胞核分布均勻、排列基本沿著膠原纖維的方向；電針組HE染色結(jié)果顯示對比正常組，成纖維細(xì)胞核數(shù)量稍密集、纖維排列較無序，對比模型組，胞核形態(tài)改變較小，纖維排列趨于規(guī)整，少數(shù)斷裂。綜合SWE測得的彈性模量及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果提示針刀和電針均可提高KOA兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)副韌帶的彈性模量，且針刀組略優(yōu)于電針組。

前期研究發(fā)現(xiàn)，針刀較電針可增強(qiáng)關(guān)節(jié)周圍軟組織剛度，增強(qiáng)其變形能力，這與本次研究結(jié)果一致[16-17]。針刀醫(yī)學(xué)認(rèn)為關(guān)節(jié)力學(xué)失衡是KOA發(fā)病的首要病理機(jī)制，在維持膝關(guān)節(jié)動態(tài)平衡的靜力性系統(tǒng)中，內(nèi)、外側(cè)副韌帶發(fā)揮著最重要的作用。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，針刀松解腘繩肌，能夠促進(jìn)MCL、LCL的再修復(fù)，使軟骨基質(zhì)退變減緩、軟骨細(xì)胞的凋亡減少。針刀通過松解膝周粘連的軟組織，對肌肉韌帶的高應(yīng)力點(diǎn)進(jìn)行減張減壓，改善因肌肉韌帶等軟組織病變引起的疼痛、神經(jīng)卡壓的相關(guān)癥狀，進(jìn)而恢復(fù)膝關(guān)節(jié)力學(xué)的動態(tài)平衡狀態(tài)最終實(shí)現(xiàn)治療KOA。電針主要利用疏密波加強(qiáng)肌肉收縮，改善膝周局部血供，抑制痛覺向中樞神經(jīng)的傳導(dǎo)來緩解KOA疼痛的癥狀，對改善KOA力學(xué)失衡的作用有限。

綜上可知，針刀松解腘繩肌及電針均能提高KOA兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)、外側(cè)副韌帶的超聲彈性模量，且針刀組比電針組的效果更佳，那么針刀松解腘繩肌治療膝骨關(guān)節(jié)炎或許是值得研究的一個新的方向。