陳烯琳，孫學(xué)燕，馬詩凝，張 偉，付昕怡，謝汶姍，郭長青△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是膝關(guān)節(jié)的一種退行性病變[1]，高發(fā)于中老年人。KOA的發(fā)病機制尚未完全清楚，F(xiàn)elson[2]指出膝周組織不平衡所致的生物力學(xué)改變是發(fā)病的重要因素。而膝周組織不僅包括半月板、韌帶，還包括強壯的伸屈肌。Qiestad BE等[3]進一步提出KOA與膝關(guān)節(jié)伸肌萎縮密切相關(guān)，健康的肌力對膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定至關(guān)重要[4]。針對這種存在股直肌萎縮的KOA，本團隊前期研究證實了針刀干預(yù)可以抑制股直肌凋亡，并促進股直肌修復(fù)[5]。其深入的修復(fù)機制是什么？Akt/mTOR通路具有調(diào)控多種細胞的代謝、增殖和生長作用[6]，并且可有效調(diào)控萎縮的骨骼肌[7]。故本研究通過Westernblot觀察Akt(又叫PKB，protein kinase B，蛋白激酶)/mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)通路及其下游p70s6k(p70 Ribosomal protein S6 kinase，p70核糖體蛋白S6激酶)的蛋白表達變化，進一步探究針刀對退行性KOA的修復(fù)機制。

1 材料與方法

1.1 動物

36只6月齡雄兔，體質(zhì)量(3.20±0.2)kg，購買自北京科宇動物養(yǎng)殖中心(動物批號：SYXK京2016-0013，SPF級新西蘭大白兔，質(zhì)量合格證號：DH201601958)，本實驗于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所完成，恒溫20～22℃，相對濕度40%～60%。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器 微型旋渦混合儀(VORTEX GENIN，美國SCIENTIFIC INDUSTRIES公司)；手掌型離心機(LX-100，中國Haimen Kylin-Bell實驗儀器公司)；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國 BIO-RAD公司)；搖床(TS-1，北京TAYASAF公司)；IEC低溫高速離心機(美國尼通公司)；FMIOO制冰機(美國格蘭特公司)；-20℃/4℃冰箱(日本三洋公司)；-80℃冰箱(中國美菱公司)；液氮罐(上海博谷公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DH-101，北京利康有限公司)；奧豪斯電子天平(AR2130，上海恭航稱重設(shè)備有限公司)；超純水機(ZYFX-108-UP，北京盛盛科技發(fā)展有限公司)；膠片夾(北京PPLYGEN有限公司)；全波長多功能酶標(biāo)儀(infinite M100，帝肯有限公司)；Chem Doc XRS+成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；X線暗盒、D72顯影粉、D72定影粉(北京PPLYGEN有限公司)；X光膠片(北京CWBIO有限公司)；水平搖床(北京市六一儀器廠)。

1.2.2 試劑 RIPA裂解液(P0013B)、PMSF(ST506)、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(P0010-1)(Beyotime)；蛋白彩色Marker(26616)、ECL發(fā)光液(34096)(Thermo公司)；5×蛋白上樣緩沖液(B1012)、1.5M Tris·HCl緩沖液(B1001)、1.0M Tris·HCl緩沖液(B1002)、30%丙烯酰胺(B1000)、AP(A1004)、四甲基乙二胺 TEMED(A1006)、10×SDS-PAGE 電泳緩沖液(B1005)、10×蛋白電轉(zhuǎn)緩沖液 10×封閉(B1006)、洗滌緩沖液(B1009)、Tween 20(A1007)(PPLYGEN有限公司)；山羊抗兔IgG(二抗)(A6154，Sigma公司)；PVDF膜(IPVH00010，Immobilon-P公司)；mTOR(2983，美國CST)；p70s6k(SC8418，美國圣克魯斯生物技術(shù)公司)；AKT(9272，美國CST)。

1.3 分組及造模方法

1.3.1 分組 飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字法將36只兔隨機分為正常組(N)、模型組(M)、針刀組(A)和電針組(EA)，每組9只，其中1只用于檢驗造模效果，其余用于指標(biāo)檢測。

1.3.2 造模 根據(jù)改良Videman[8]左后膝伸直位固定制動法制備KOA模型。兩名研究者共同操作，將家兔仰臥固定，保持左后肢膝關(guān)節(jié)完全伸直，踝部充分背伸。先用脫脂棉包裹膝關(guān)節(jié)減緩壓迫，再用樹脂繃帶纏繞整個家兔左后肢定型。于外層用高分子材料加固，并纏上防啃咬繃帶。全程保持模具松緊適度并且外露足趾以觀察腫脹瘀血情況。若模具下滑、破損予以加固，若后肢末端腫脹予以松解。6周造模結(jié)束后，用隨機數(shù)法從每組選1只家兔處死，觀測關(guān)節(jié)軟骨的病理改變是否符合要求，造模成功則拆除固定。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 N組 不處理，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4.2 M組 造模成功后操作同N組。

1.4.3 A組 造模成功1周后，予以針刀干預(yù)治療。具體干預(yù)方法：將KOA兔固定后，用標(biāo)記筆點出股內(nèi)、外側(cè)肌腱以及股二頭肌、股直肌周圍的條索結(jié)節(jié)點，每次治療選擇2～3點。備皮消毒后，左手加壓分離，右手持針刀垂直皮膚刺入，保持刀柄方向與肌腱走勢相同，著重松解條索結(jié)節(jié)以及肌腱和骨面連接處，每點松解2～3刀，操作完成后拔出針刀并按壓止血。治療頻次2次/周， 共4周累計8次。

1.4.4 EA組 造模成功1周后開始進行電針治療，根據(jù)《實驗針灸學(xué)》[9]選取梁丘-血海與內(nèi)膝眼-外膝眼兩組穴位，用毫針刺入5 mm,并用韓式穴位神經(jīng)刺激儀以疏密波分別連接，進行電針治療(電流參數(shù)：F=2/100 Hz，I=3 mA)。治療頻次10 min/次，3次/周，共4周累計12次。

1.5 檢測方法及指標(biāo)

1.5.1 大腿圍度測量 將兔左后肢大腿備皮，一人將兔固定于操作臺上，另一人持皮尺測量腹股溝下緣、髕骨上緣以及兩者連線中點位置的大腿圍度，記錄數(shù)據(jù)。

1.5.2 取材方法 治療結(jié)束1周后，各組家兔采用戊巴比妥進行全身麻醉，左后肢備皮干凈后，于左后肢股骨近髕骨的前側(cè)開口，仔細剝離淺層筋膜，于髕上2 cm處取肌肉，規(guī)格為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，迅速裝瓶并液氮保存。

1.5.3 股直肌組織中Akt、mTOR、p70s6k蛋白表達檢測 采用Western Blot進行檢測，取凍存的兔左后肢的股直肌組織，研磨后，于冰上用RIPA裂解液進行裂解，離心取上層清液，BCA法測定蛋白濃度。電泳后進行電轉(zhuǎn)、封閉，并用PBS稀釋液稀釋一抗mTOR(1/2 000)、p70s6k(1/1 000)、AKT(1/1 000),4℃孵育過夜。 0.5% Tween 20洗膜 5 次，每次5 min，然后將山羊抗兔IgG(二抗)稀釋至1∶20 000。孵育后再用0.5% Tween 20洗膜5次，每次5 min。最后使 A 液與 B 液等量混合均勻，進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯影后用Image Lab進行蛋白條帶的數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS22.0(20150408-LSBJ，北京中醫(yī)藥大學(xué)，中國)統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，檢驗各組數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性與各組間方差齊性，若正態(tài)分布且方差齊則用方差分析進行統(tǒng)計，否則用非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 各組大腿圍度測量結(jié)果

腹股溝下緣M組、A組及EA組的大腿圍度均顯著小于N組(P<0.05或P<0.01)，A組大于M組(P<0.05)，與EA組相比，A組、M組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；髕上緣各組之間大腿圍度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；中點位置M組、A組和EA組之間的大腿圍度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但都顯著小于N組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大腿圍度測量結(jié)果

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01;與模型組相比，△P<0.05。

2.2 各組股直肌Akt、mTOR、p70s6k蛋白表達

Western Blot法檢測各組實驗性KOA兔股直肌Akt、mTOR、p70s6k蛋白表達結(jié)果：M組較N組股直肌中mTOR和p70s6k、Akt蛋白的表達水平顯著降低(P<0.01或P<0.05)；干預(yù)后Akt蛋白表達：A組與EA組相比模型組顯著升高(P<0.01)；干預(yù)后mTOR蛋白表達：相比M組，A組與EA組升高(P<0.01或P<0.05)；干預(yù)后p70s6k蛋白表達：A組較M組顯著升高(P<0.05)，而EA組與M組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1～2。

表2 各組股直肌Akt、mTOR、p70s6k蛋白相對表達水平

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01;與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01;與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。圖1 各組股直肌Akt、mTOR、p70s6k蛋白相對表達量

圖2 各組股直肌Akt、mTOR、p70s6k Western blot條帶圖

3 討論

KOA的動物模型制備方法有很多種，目前較為常用的是關(guān)節(jié)內(nèi)注射法、手術(shù)法和制動法。關(guān)節(jié)內(nèi)注射木瓜蛋白酶主要通過分解軟骨基質(zhì)的蛋白多糖，造成軟骨退變的KOA模型[10]，但與臨床上因膝周力學(xué)改變引起的病變在機制上差異較大。研究指出各種原因引起的膝關(guān)節(jié)周圍肌肉無力、應(yīng)力不平衡是引起KOA的重要原因[11]。從這個切入點，手術(shù)法[12]與關(guān)節(jié)制動法[8]更能復(fù)刻出力學(xué)失衡的發(fā)病過程。但是手術(shù)法打開了關(guān)節(jié)囊，屬于有創(chuàng)性造模，影響關(guān)節(jié)的初始結(jié)構(gòu)。而關(guān)節(jié)制動法可使那些制動時長度比靜止?fàn)顟B(tài)長度短的肌肉(本研究中為股直肌)出現(xiàn)明顯的萎縮[13]，更加適合本研究的探索。故本實驗沿用改良videman法進行造模。

與此同時，最新的研究也指出，股四頭肌無力會增加膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的可能[14]。針對退行性KOA中肌肉無力的特點，國外的研究者從股四頭肌無力入手治療KOA，發(fā)現(xiàn)鍛煉激活股四頭肌可以有效地改善中、重度KOA患者的臨床癥狀[15]，這與中醫(yī)的治療思路有異曲同工之秒。從中醫(yī)的角度而言，郝軍[16]提出“筋為骨用”的治療思路，并且在經(jīng)筋理論的指導(dǎo)下，眾多中醫(yī)方法干預(yù)KOA均取得良好的效果[17]。針刀療法將傳統(tǒng)針灸機械牽拉的特點與手術(shù)刀松解的特點相結(jié)合[18]，松解軟組織，具有調(diào)整力學(xué)失衡、改善股直肌力學(xué)特性[19]、抑制股直肌中Bax、Caspase-3凋亡相關(guān)蛋白表達[5]從而促進股直肌的修復(fù)的作用，減緩KOA的進程。

相關(guān)研究表明Akt-mTOR可感知環(huán)境和細胞內(nèi)的變化，整合各種外界信號刺激后調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、自噬及凋亡等[6]。在肌腱損傷的動物模型中，該通路會被下調(diào)，使自噬-溶酶體系統(tǒng)增強，加重肌肉蛋白質(zhì)的水解進而導(dǎo)致肌肉萎縮[20]。因此，抑制自噬-溶酶體途徑可以有效地減緩肌肉萎縮，促進恢復(fù)。與此同時，近年來有研究指出，該通路可介導(dǎo)自噬、凋亡等多種途徑調(diào)控骨骼肌蛋白質(zhì)合成，預(yù)防肌肉萎縮，與骨骼肌修復(fù)密切相關(guān)[21]。在本實驗中，造模之后，Akt、mTOR蛋白表達顯著降低，提示造模給肌肉細胞造成應(yīng)激后，激活其自噬-溶酶體系統(tǒng)，對局部受損細胞進行清除以維持能量代謝來對抗外界的變化，肌肉出現(xiàn)了萎縮。并且造模后腹股溝下緣、髕上緣大腿圍度均顯著小于正常組，進一步證實肌肉出現(xiàn)了萎縮。而針刀、電針均上調(diào)了該通路，提示股直肌的萎縮被抑制，可見兩種干預(yù)均打破了KOA膝周 “力學(xué)失衡-股直肌萎縮”的惡性循環(huán)，有效地阻遏了病程進展。

p70s6k作為Akt/mTOR下游主要的效應(yīng)因子，通過上游的級聯(lián)激活后，可以有效地促進細胞增殖[22]。該因子的高表達不僅介導(dǎo)細胞中蛋白質(zhì)的合成，還介導(dǎo)血管生成[23]。研究表明p70s6k的激活可以對骨骼肌起到保護作用，減少肌肉被破壞以及抑制細胞凋亡，對萎縮的骨骼肌有積極的作用[24]。本實驗結(jié)果顯示，針刀干預(yù)后股直肌p70s6k蛋白表達相比模型組顯著升高，逆轉(zhuǎn)了股直肌萎縮的狀態(tài)，蛋白質(zhì)合成升高，血管生成，呈現(xiàn)出修復(fù)狀態(tài)，該過程由Akt/mTOR通路介導(dǎo)并協(xié)同完成，進一步印證針刀對股直肌的修復(fù)作用，與行為學(xué)結(jié)果相符合。而電針干預(yù)后，p70s6k蛋白表達與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與行為學(xué)結(jié)果相印證，但與通路結(jié)果不一致，故其由akt/mTOR通路介導(dǎo)修復(fù)股直肌的途徑尚不清楚，這可能是針刀與電針兩種干預(yù)方法的差異所在，需進一步探索。

綜上，針刀通過上調(diào)akt/mTOR及p70s6k的蛋白表達，修復(fù)萎縮的股直肌，改善膝周軟組織的生物力學(xué)，促進膝關(guān)節(jié)的恢復(fù)。