(焦作市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 焦作 454002)

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，全球老齡化進(jìn)程逐漸加快，導(dǎo)致阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病率不斷升高，如何應(yīng)對(duì)AD已經(jīng)成為我國(guó)重要的公共衛(wèi)生安全和社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)問(wèn)題之一[1]。目前關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，診療手段也不完善[2]，因此早診斷、早干預(yù)被認(rèn)為是延緩疾病進(jìn)程的關(guān)鍵。從已知的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制分析，AD進(jìn)程可以分為病理生理學(xué)階段和臨床階段[3]。有研究認(rèn)為早在AD患者出現(xiàn)臨床癥狀前幾十年，腦脊液中β淀粉樣蛋白(Aβ)水平即出現(xiàn)降低趨勢(shì)[4]。大腦和皮質(zhì)海馬區(qū)Aβ沉積形成老年斑是AD發(fā)生的早期病理學(xué)特征[5]，因此檢測(cè)腦脊液中Aβ含量是早期診斷AD與其他神經(jīng)退行性疾病的有效手段，甚至可以比正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層現(xiàn)象(PET)更早檢測(cè)出Aβ沉積[6]。但自腦脊液中提取Aβ并不方便，最新研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)結(jié)合免疫沉淀法以及質(zhì)譜分析法檢測(cè)血清中Aβ相關(guān)肽段水平來(lái)反映大腦中Aβ的沉積水平[7]。除此以外，微小核糖核酸(miRNAs)與AD的發(fā)生和發(fā)展也密切相關(guān)。有研究通過(guò)miRNAs基因芯片篩選后發(fā)現(xiàn)miR-25在AD患者大腦海馬組織和循環(huán)血漿中均呈低表達(dá)，推測(cè)其與神經(jīng)系統(tǒng)性疾病有關(guān)[8]?？紤]到循環(huán)miRNAs具有高度的穩(wěn)定性和特異性，分離、檢測(cè)操作簡(jiǎn)單易行，因此本研究旨在探尋與Aβ沉積有關(guān)的miR-25在認(rèn)知功能障礙(CI)患者血清中表達(dá)的變化，為AD患者臨床診斷生物學(xué)標(biāo)志物的篩選提供依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月—2019年3月我院確診為CI的患者(CI組)98例，根據(jù)認(rèn)知程度分為AD患者41例(AD組)，輕度CI(MCI)患者57例(MCI組)。其中AD組患者中男31例，女10例，年齡59～86歲，平均為(72.38±5.79)歲，均符合美國(guó)國(guó)立神經(jīng)學(xué)、語(yǔ)言功能障礙和中風(fēng)研究所規(guī)定的“疑似AD”的診斷的標(biāo)準(zhǔn)[9]，且通過(guò)簡(jiǎn)易智能精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)[10]評(píng)分<最低閾值，Hachinski評(píng)分<4分。MCI組患者中男39例，女18例，年齡為61～87歲，平均為(73.68±5.94)歲，MMSE評(píng)分≥最低閾值，且≤26分，Hachinski評(píng)分<4分。所有的患者均排除帕金森病、血管性癡呆、惡性腫瘤以及心血管器質(zhì)性疾病。另外選擇同期在我院進(jìn)行神經(jīng)精神檢查正常者50例作為對(duì)照組，并且排除患有惡性腫瘤以及心血管器質(zhì)性病變者，對(duì)照組中男30例，女20例，年齡為60～85歲，平均為(73.65±6.10)歲，MMSE評(píng)分為27～30分。3組研究對(duì)象的年齡、性別、受教育年限、糖尿病史、高血壓史、高脂血癥史、吸煙史、飲酒史等基本資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對(duì)象均知情同意，本研究已獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器

CFX-96-C1000 real-time PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；5810R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)以及移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；EDTA-K2真空采血管(美國(guó)Becton Dickinson公司)。Aβ40以及Aβ42放射免疫分析試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程公司)；血清miRNeasy快速提取分離試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；miScript SYBR Green PCR kit(德國(guó)Qiagen公司)。

1.3 研究方法

所有研究對(duì)象入組后24 h內(nèi)采集空腹肘靜脈血5 mL，室溫靜置2 h，3 500 r/min離心20 min，離心半徑13.5 cm，取上清，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙鍢颖?，?fù)溶后，采用血清miRNeasy提取試劑盒提取血清總RNAs，并檢測(cè)其純度和濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNAs逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并-20 ℃保存?zhèn)溆?。配?5 μL實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)反應(yīng)體系(12.5 μL SYBR Premix Taq+2 μL引物+2 μL模板+8.5 μL雙蒸水)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；然后95 ℃變性5 s，58 ℃退火20 s，重復(fù)循環(huán)45次。收集熒光信號(hào)，每個(gè)反應(yīng)體系的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)記為CT值，以小分子U6為內(nèi)參照，采用2-△△CT計(jì)算miR-25相對(duì)表達(dá)量。miR-25引物序列：上游引物：5′-TGCGCTAGCACCATCTGAAAT-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。小分子U6引物序列：上游引物：5′-TCCTCAGGTTGGCA-CAGGTG-3′，下游引物：5′-CACGTGTCGGTCAG-TCCTCA-3′。血清Aβ40和Aβ42水平檢測(cè)嚴(yán)格遵循試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。記錄所有受試對(duì)象血清中miR-25、Aβ40以及Aβ42水平，并計(jì)算Aβ42/Aβ40比值。通過(guò)受試者工作特征曲線(ROC曲線)評(píng)價(jià)miR-25、Aβ40、Aβ42、Aβ42/Aβ40對(duì)CI以及AD患者的診斷價(jià)值。同時(shí)記錄所有研究對(duì)象的MMSE評(píng)分情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組MMSE評(píng)分比較

對(duì)照組、MCI組和AD組患者M(jìn)MSE評(píng)分分別為(28.42±0.93)、(22.35±2.64)和(14.66±5.05)分，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=212.847，P<0.05)；MCI組和AD組患者M(jìn)MSE評(píng)分明顯低于對(duì)照組，且以AD組患者M(jìn)MSE評(píng)分最低，差異有顯著性(q=14.000～29.179，P<0.05)。

2.2 各組血清中miR-25、Aβ水平比較

3組患者血清中miR-25水平、Aβ42水平、Aβ42/Aβ40比值比較，差異均具有顯著意義(F=11.172～81.957，q=4.935～17.953，P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 CI患者血清中miR-25、Aβ水平與MMSE評(píng)分的關(guān)系

CI患者血清中miR-25及Aβ42水平、Aβ42/Aβ40比值和MMSE評(píng)分呈正相關(guān)性(r=0.165～0.691，P<0.05)；而且患者血清中miR-25水平與Aβ42水平以及Aβ42/Aβ40比值也均呈正相關(guān)性(r=0.184、0.339，P<0.05)。

2.4 血清中miR-25、Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值對(duì)CI和AD患者的診斷價(jià)值

應(yīng)用ROC曲線分析血清中miR-25以及聯(lián)合Aβ42、Aβ42/Aβ40比值診斷CI和AD效能，結(jié)果顯示miR-25+Aβ42+Aβ42/Aβ40對(duì)CI和AD診斷的靈敏度(84.34%、90.12%)和特異度(70.61%、84.13%)最高，而且診斷的效能最高(AUC分別為0.875、0.920)。見(jiàn)表2。

組別nmiR-25Aβ40(ρ/ng·L-1)Aβ42(ρ/ng·L-1)Aβ42/Aβ40對(duì)照組501.00±0.0742.41±12.3019.85±4.090.47±0.10MCI組570.85±0.0944.93±13.0217.47±3.140.39±0.09AD組410.73±0.1445.08±13.1516.52±3.260.35±0.06

表2 血清中miR-25、Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值對(duì)CI和AD患者的診斷價(jià)值

指標(biāo)組別AUC95%CI靈敏度(χ/%)特異度(χ/%)miR-25CI組0.8150.672～0.91880.7362.88AD組0.8870.765～0.95285.1965.42Aβ42CI組0.5360.379～0.69067.1370.82AD組0.3760.229～0.47350.1852.85Aβ42/Aβ40CI組0.6700.451～0.82472.1550.76AD組0.4780.307～0.68952.3055.68三者聯(lián)合CI組0.8750.770～0.95684.3470.61AD組0.9200.879～0.99590.1284.13

3 討 論

AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且病程長(zhǎng)，臨床上尚未出現(xiàn)有治愈可能的藥物，只能以延緩疾病進(jìn)展為主要治療原則[11-13]。2018年，在AD協(xié)會(huì)國(guó)際會(huì)議上各國(guó)專(zhuān)家達(dá)成共識(shí)，認(rèn)為未來(lái)AD臨床治療工作主要是提高對(duì)AD無(wú)癥狀期預(yù)防工作的重視，改變重治療、輕預(yù)防的錯(cuò)誤做法[14]。而早期診斷是AD患者早期干預(yù)的關(guān)鍵。同年，由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科主任韓瓔教授牽頭成立了中國(guó)AD臨床前期聯(lián)盟[15]，該聯(lián)盟成員以認(rèn)知功能下降人群為研究突破口，以“尋找AD早期診斷生物學(xué)標(biāo)志物”為主要工作內(nèi)容，緊跟國(guó)際學(xué)術(shù)前沿，希望推動(dòng)我國(guó)AD治療的跨越式發(fā)展。

眾所周知，大腦海馬組織中胞外淀粉樣斑塊是AD主要的病變特征[16]。由淀粉樣前體蛋白裂解生成的Aβ是老年斑的核心成分，可誘導(dǎo)神經(jīng)元進(jìn)行性損傷，逐漸引起患者CI和癡呆[17]。目前已知的腦組織中含量最豐富的Aβ是Aβ40以及Aβ42，尤其以Aβ42為最具藥理活性的多肽片段[18]，早在上個(gè)世紀(jì)末就有學(xué)者證實(shí)腦脊液中Aβ蛋白是較為可靠的早期AD診斷的分子標(biāo)志物。MOONIS等[19]認(rèn)為患者腦脊液中Aβ42水平降低先于認(rèn)知功能下降。MONDRAGN等[20]證實(shí)腦脊液中Aβ42水平變化可以反映纖維狀A(yù)β蛋白的含量，從而間接反映老年斑聚集狀態(tài)。但是腦脊液取材不便，屬于侵入性操作，多數(shù)患者不易接受。最近日本學(xué)者通過(guò)結(jié)合免疫沉淀法和質(zhì)譜分析法檢測(cè)了循環(huán)血漿中大量Aβ片段，發(fā)現(xiàn)通過(guò)綜合分析Aβ蛋白含量以及不同Aβ片段比例，可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)個(gè)體大腦中Aβ斑塊沉積水平。和目前的技術(shù)相比，這些血漿生物標(biāo)志物取材方便且操作簡(jiǎn)單，更經(jīng)濟(jì)，擴(kuò)展性也更強(qiáng)，有望廣泛應(yīng)用于臨床。JANELIDZE等[21]進(jìn)行的一項(xiàng)大樣本的研究分析發(fā)現(xiàn)，血漿中Aβ42水平以及Aβ42/Aβ40比值在AD患者中降低。本研究結(jié)果也顯示，與對(duì)照組相比較，MCI組和AD組患者血清中miR-25、Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值均降低，而且AD組患者血清中miR-25水平以及Aβ42/Aβ40比值降低更明顯。但是經(jīng)ROC曲線分析，Aβ42水平和Aβ42/Aβ40比值對(duì)于AD和CI患者的單獨(dú)診斷效能較低，反而miR-25的診斷價(jià)值更高?？紤]到本研究納入的樣本量偏少，不可避免會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)一定的假陽(yáng)性結(jié)果，這也是本研究涉及的主要缺陷所在。但是無(wú)論如何，血清中miR-25在MCI和AD患者中確實(shí)表現(xiàn)出明顯的表達(dá)差異，而且證實(shí)與患者的認(rèn)知功能狀態(tài)有關(guān)。

miRNAs是近年來(lái)全球醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)[22]。但是其在AD方面的研究起步尚晚[23]。有學(xué)者通過(guò)miRNAs基因芯片技術(shù)篩查了AD患者或CI人群miRNAs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)包括miR-25、miR-29b等多種基因呈異常低表達(dá)，推測(cè)大量miRNAs可能參與Aβ斑塊沉積以及Tau蛋白磷酸化等過(guò)程[24]。SRK?ZY等[25]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，miR-25通過(guò)靶向調(diào)控淀粉樣前體蛋白基因的表達(dá)，進(jìn)而參與AD的發(fā)病過(guò)程。DUAN等[26]也證實(shí)上調(diào)miR-25表達(dá)可抑制Aβ42沉積造成的大鼠海馬組織神經(jīng)元損傷。除了miR-25可直接結(jié)合APP 3′-端氨基酸序列或者APP相關(guān)的調(diào)控元件等外，miR-25可能還與Aβ產(chǎn)生的限速酶-β淀粉樣前體蛋白裂解酶1(BACE1)的表達(dá)有關(guān)。PIENIMAEKI等[27]研究顯示，miR-25可抑制BACE1的表達(dá)，進(jìn)而降低腦組織中Aβ水平。本研究結(jié)果也顯示，MCI和AD患者的血清中miR-25水平明顯低于對(duì)照組，而且AD患者血清中miR-25水平降低更明顯。MMSE量表是國(guó)際上使用最普及的認(rèn)知障礙篩查工具之一[28-30]。本研究結(jié)果顯示，AD患者M(jìn)MSE評(píng)分顯著低于對(duì)照組和MCI組。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清中miR-25水平和MMSE評(píng)分、Aβ42水平以及Aβ42/Aβ40比值呈正相關(guān)性，并且與Aβ42水平和Aβ42/Aβ40比值相比，miR-25單獨(dú)診斷AD和MCI+AD患者的價(jià)值較高，說(shuō)明miR-25、Aβ42水平以及Aβ42/Aβ40比值都與CI患者的認(rèn)知功能障礙存在一定的相關(guān)性。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)屬于橫斷面研究，只是從臨床角度證實(shí)miR-25與受試人群認(rèn)知功能狀態(tài)以及Aβ蛋白分子表達(dá)有關(guān)，尚未涉及到相關(guān)機(jī)制的研究。

綜上所述，CI患者血清中miR-25、Aβ42水平以及Aβ42/Aβ40比值明顯低于正常對(duì)照人群，而且隨著CI的進(jìn)展，該3項(xiàng)指標(biāo)也逐漸降低。聯(lián)合檢測(cè)上述3項(xiàng)指標(biāo)對(duì)于CI和AD具有良好的診斷效能。但是是否可作為臨床現(xiàn)有診斷手段的輔助指標(biāo)，尚需通過(guò)縱向研究明確miR-25和Aβ42在AD發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，并進(jìn)一步采取大樣本研究豐富miR-25在CI患者中表達(dá)的循證數(shù)據(jù)，以證實(shí)本文結(jié)論的可靠性。