陳雅楠 楊堃2 孟旭霞 王一博 楊靜

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266500 1 眼科； 2 中心實(shí)驗(yàn)室)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病的常見微血管并發(fā)癥，也是糖尿病患者致盲的最常見原因[1]，視網(wǎng)膜因缺氧導(dǎo)致新生血管形成是其發(fā)病的重要因素[2]。研究表明長鏈非編碼RNA(LncRNA)是糖尿病并發(fā)癥病理過程中的重要調(diào)節(jié)因子[3-6]。小核仁RNA宿主基因5(SNHG5)是snoRNA U50以及U50宿主基因外顯子的成熟剪切體[7-8]。為了探討SNHG5對(duì)視網(wǎng)膜微血管的作用，本研究選用人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRCECs)建立體外高糖缺氧模型，選用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染SNHG5過表達(dá)質(zhì)粒，觀察SNHG5對(duì)高糖缺氧誘導(dǎo)的HRCECs凋亡和遷移能力的影響，以期為DR的預(yù)防和治療提供新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

HRCECs購自美國ScienCell公司。細(xì)胞培養(yǎng)試劑DMEM培養(yǎng)基購自上海中喬新舟生物科技有限公司；胎牛血清、青霉素和鏈霉素、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、胰蛋白酶及PBS購自美國Gibco公司；葡萄糖購自美國Invitrogen公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)主要試劑細(xì)胞裂解液、核DNA清除反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；RT-qPCR所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。SNHG5過表達(dá)型質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海東仁化學(xué)科技有限公司。

1.2 HRCECs的培養(yǎng)及分組處理

HRCECs由液氮罐中取出后置于37 ℃水浴鍋中融化復(fù)蘇，以1 000 r/min離心 3 min后，棄上清液，移入加有5 mL且含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM混合培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中，隔日換液。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時(shí)，按照1∶3的比例傳代培養(yǎng)，將HRCECs接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，留取狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)分為 5組，分別為正常對(duì)照組(A組)、高糖組(B組)、高糖缺氧組(C組)、高糖缺氧過表達(dá)組(D組)、高糖缺氧空載組(E組)。各組細(xì)胞處理如下：① A組：HRCECs接種于含有5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基當(dāng)中，然后置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；②B組：HRCECs接種于含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中，然后置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；③C組：HRCECs接種于含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中，并且置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.01 O2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；④D組：利用脂質(zhì)體LipofectimineTM2000將其中含有SNHG5目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HRCECs，再將其接種于含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中，并且置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.01 O2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；⑤E組：利用脂質(zhì)體LipofectimineTM2000將含有與D組等量的陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HRCECs，將其接種于含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為0.01 O2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 RT-qPCR方法測(cè)定細(xì)胞中SNHG5基因相對(duì)表達(dá)量

將HRCECs以105個(gè)/孔的密度均勻接種至6孔板中，待細(xì)胞貼壁12 h后，更換無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)細(xì)胞使其同步化，按上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組并處理細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。取處理后的各組細(xì)胞，棄液后胰酶消化，PBS沖洗，使用Trizol試劑分組提取細(xì)胞總RNA，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長260以及280 nm處的吸光度(A)值，測(cè)定總RNA的純度和濃度。應(yīng)用去除基因組DNA反應(yīng)體系，酶解各組實(shí)驗(yàn)樣本中的DNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的cDNA，并按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa，Japan)說明書中要求配置熒光反應(yīng)體系，在八聯(lián)管中以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，SNHG5上游引物序列：5′-GAGCAGCTCTGAAGATGCAAAGA-3′，下游引物序列：5′-GCTACTCGTCCACACTCAGAACG-3′；內(nèi)參照為β-actin，β-actin上游引物序列：5′-CGAG-AAGATGACCCAGAT-3′，下游引物序列：5′-GA-TAGCACAGCCTGGATA-3′。定量分析結(jié)果以熒光強(qiáng)度(CT值)表示，待檢基因表達(dá)水平以β-actin作為參比，采用2-△△CT法計(jì)算待檢基因相對(duì)含量，以判定基因上調(diào)或下調(diào)幅度。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以4×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右。稀釋脂質(zhì)體LipofectimineTM2000和質(zhì)粒并各自孵育5 min后，混合脂質(zhì)體和質(zhì)粒，后室溫靜置20 min，按照LipofectimineTM2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明書轉(zhuǎn)染HRCECs，D組轉(zhuǎn)入含有SNHG5目的基因的質(zhì)粒，E組轉(zhuǎn)入與D組等量的陰性對(duì)照體，A～C組不做細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理。4～6 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，更換為新鮮的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24～48 h后觀察質(zhì)粒上熒光標(biāo)記基因的表達(dá)情況，待熒光率達(dá)80%后補(bǔ)加500 μL正常培養(yǎng)基，于細(xì)胞的融合度達(dá)到90%時(shí)收集細(xì)胞。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

取A～E組HRCECs，經(jīng)胰酶消化后接種于6孔板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組并相應(yīng)處理細(xì)胞，將HRCECs培養(yǎng)于不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2或體積分?jǐn)?shù)0.01 O2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；加入胰蛋白酶終止消化，PBS液沖洗3次，1 000 r/min離心5 min重懸細(xì)胞，均勻分成四管，分別標(biāo)號(hào)為1、2、3、4；其中1號(hào)管不加任何試劑，2號(hào)管加入5 μL Annexin V-FITC，3號(hào)管加入5 μL PI，4號(hào)管加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI；輕混勻后室溫下避光靜置反應(yīng)15 min，加PBS每管補(bǔ)至1 mL后混勻，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用分析程序軟件進(jìn)行處理，顯示出細(xì)胞凋亡百分比。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將生長狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)期的HRCECs接種于6孔板中，用無菌200 μL移液槍頭垂直于培養(yǎng)板底畫“一”字水平劃痕，形成一個(gè)無細(xì)胞區(qū)，PBS洗滌2次去除離壁漂浮的細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)液，將6孔板置于不同氧濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別于培養(yǎng)后第0、12和36小時(shí)在倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。用Image J圖像分析軟件分別測(cè)量初始無細(xì)胞區(qū)面積與當(dāng)前無細(xì)胞區(qū)面積，細(xì)胞相對(duì)遷移面積=(初始無細(xì)胞區(qū)面積-當(dāng)前無細(xì)胞區(qū)面積)/第36小時(shí)無細(xì)胞區(qū)面積×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組HRCECs中SNHG5相對(duì)表達(dá)量變化

RT-qPCR方法檢測(cè)結(jié)果示，A～E組HRCECs中SNHG5基因的相對(duì)的表達(dá)量分別為1.006±0.101、0.487±0.474、0.335±0.271、1.609±0.153以及0.985±0.131，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=278.007,P<0.05)。HRCECs中SNHG5的相對(duì)表達(dá)量B組低于A組(P<0.05)，C組低于B組(P<0.05)，D、E組高于C組(P<0.05)，D組高于E組(P<0.05)，其他任意2組間比較差異均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組HRCECs凋亡百分比比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，A～E組HRCECs的凋亡百分比分別為(2.093±0.146)%、(20.690±1.117)%、(28.683±1.728)%、(14.250±0.276)%和(27.697±0.594)%，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=384.415,P<0.05)。細(xì)胞的凋亡百分比B組明顯高于A組(P<0.05)，C組高于B組(P<0.05)，D組低于C、E組(P<0.05)，其他任意2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 各組HRCECs相對(duì)遷移面積比較

析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間、組別及其交互作用均對(duì)HRCECs相對(duì)遷移面積有明顯影響(F組別=252.93,F時(shí)間=791.36,F時(shí)間*組別=169.89,P<0.05)。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，A～E組HRCECs的相對(duì)遷移面積均逐漸增大(F=11.64～186.76,P<0.05)；第12和36小時(shí)A～E組細(xì)胞相對(duì)遷移面積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=102.28、268.84，P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，B組細(xì)胞在培養(yǎng)后第12和36小時(shí)的相對(duì)遷移面積均高于A組(P<0.05)，C組高于B組(P<0.05)，D組低于C、E組(P<0.05)，其他任意2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)相對(duì)遷移面積比較

3 討 論

隨著LncRNA所受的關(guān)注越來越多，其在血管生物學(xué)中的作用逐漸被學(xué)術(shù)界所認(rèn)識(shí)[9-14]。研究表明，LncRNASNHG12具有促進(jìn)氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧后的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成以及改善腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用[15]。SNHG5在多種人類癌癥中表達(dá)異常[16-19]，如SNHG5在胃癌、結(jié)腸癌等癌癥組織中表達(dá)下調(diào)，并可通過MIR-132-3p途徑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[20-21]。

本研究以HRCECs為研究對(duì)象，為模擬糖尿病患者視網(wǎng)膜內(nèi)的高糖缺氧環(huán)境，將高糖環(huán)境培養(yǎng)的HRCECs置于含氧體積分?jǐn)?shù)為0.01的培養(yǎng)箱內(nèi)，進(jìn)行體外高糖缺氧環(huán)境的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，B組SNHG5的表達(dá)量低于A組，C組SNHG5的表達(dá)量低于B組，表明高糖缺氧培養(yǎng)可以引起HRCECs中SNHG5的表達(dá)下調(diào)。目前，多項(xiàng)研究結(jié)果表明，SNHG5基因在胃癌、腦膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中具有致癌作用[22-24]。此外，外源性沉默SNHG5基因可促進(jìn)膀胱癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，并抑制相應(yīng)細(xì)胞的增殖能力[25]。本研究將含有SNHG5目的基因的質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)入HRCECs中，RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，D組的SNHG5基因表達(dá)量明顯高于C組，說明通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的HRCECs能夠高表達(dá)SNHG5。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D組HRCECs細(xì)胞的凋亡百分比明顯低于C組，說明過表達(dá)SNHG5基因可以抑制高糖缺氧環(huán)境誘導(dǎo)的HRCECs凋亡，從而提示SNHG5對(duì)HRCECs的凋亡過程具有調(diào)控作用。

研究證實(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力越強(qiáng)，越有利于新生血管的形成[26]。本研究中利用細(xì)胞劃痕法觀察SNHG5對(duì)HRCECs遷移能力的影響。結(jié)果顯示，B組細(xì)胞第36小時(shí)細(xì)胞相對(duì)遷移面積高于A組，C組細(xì)胞第36小時(shí)細(xì)胞相對(duì)遷移面積高于B組，說明高糖缺氧環(huán)境可增加HRCECs的遷移能力；同時(shí)發(fā)現(xiàn)D組細(xì)胞第36小時(shí)細(xì)胞相對(duì)遷移面積低于C組，因此推測(cè)在高糖缺氧環(huán)境中SNHG5對(duì)HRCECs遷移起抑制作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SNHG5可能在抑制糖尿病性新生血管形成的過程中起重要作用。

DAMAS等[18]相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，過表達(dá)SNHG5可抑制奧沙利鉑介導(dǎo)的直腸癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)富含絲氨酸精子發(fā)生相關(guān)蛋白2(SPATS2)是SNHG5重要的直接靶點(diǎn)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖具有重要調(diào)節(jié)作用。下調(diào)SNHG5可以破壞SPATS2 mRNA的穩(wěn)定性，顯著降低SPATS2蛋白的表達(dá)，而過表達(dá)SNHG5可以導(dǎo)致SPATS2 mRNA穩(wěn)定性以及蛋白表達(dá)增加[18]。因此，我們推測(cè)SNHG5在HRCECs增殖過程中的調(diào)節(jié)作用可能通過SPATS2途徑實(shí)現(xiàn)，但具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)僅在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的層面上進(jìn)行研究，然而視網(wǎng)膜新生血管形成的通路錯(cuò)綜復(fù)雜，是多種因子共同作用的結(jié)果。我們后期的研究將通過構(gòu)建體外新生血管模型或采用糖尿病動(dòng)物模型，進(jìn)一步探究SNHG5在DR中的調(diào)控機(jī)制以及具體的信號(hào)通路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)高糖缺氧環(huán)境培養(yǎng)可以顯著下調(diào)HRCECs中SNHG5基因的表達(dá)，而過表達(dá)SNHG5對(duì)HRCECs在高糖缺氧環(huán)境下的凋亡和遷移起抑制作用。提示SNHG5在抑制糖尿病性新生血管生成中發(fā)揮著重要的正向調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果為LncRNA在DR預(yù)防和治療中發(fā)揮調(diào)控作用提供了更多的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。