崔方強(qiáng) 王悅芬 高彥彬 江心燦 趙文景

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科，北京 100010)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是臨床常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥之一，其發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為終末期腎病的主要原因[1]。DN的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未完全闡明，有研究認(rèn)為腎小球系膜細(xì)胞過(guò)度增殖及細(xì)胞外基質(zhì)增生是DN早期特征性的病理改變[2]。而系膜細(xì)胞外泌體miR-192在系膜細(xì)胞肥大及細(xì)胞外基質(zhì)增生方面發(fā)揮著重要作用[3]，還會(huì)通過(guò)自分泌或旁分泌途徑影響系膜細(xì)胞及足細(xì)胞，進(jìn)而介導(dǎo)系膜細(xì)胞及足細(xì)胞損傷[4]。因此，系膜細(xì)胞外泌體miR-192水平異常被認(rèn)為是導(dǎo)致DN進(jìn)展的重要病理機(jī)制。保腎通絡(luò)方是我們臨床治療DN的經(jīng)驗(yàn)方，臨床研究已經(jīng)證實(shí)其對(duì)DN具有很好的治療效果，可明顯降低患者蛋白尿水平，改善腎功能[5]。同時(shí)，前期實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，保腎通絡(luò)方可以有效減輕DN小鼠足細(xì)胞損傷，改善腎臟病理表現(xiàn)[6]。為進(jìn)一步探討保腎通絡(luò)方治療DN的作用機(jī)制，我們擬通過(guò)觀察其對(duì)高糖培養(yǎng)下腎小球系膜細(xì)胞基質(zhì)增生及外泌體miR-192表達(dá)的影響，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠20只，8周齡，體質(zhì)量(203.28±14.67)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 永生化小鼠腎小球系膜細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供，批號(hào)：SV40 MES 13。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 保腎通絡(luò)方顆粒劑，主要由黃芪、熟地黃、菟絲子、劉寄奴、鬼箭羽、水蛭及丹參組成，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥劑科制備，每1 g顆粒劑含4.01 g生藥。

1.3 主要試劑及儀器 小鼠膠原蛋白Ⅳ(Collagen Ⅳ)抗體、纖維連接蛋白(FN)抗體(英國(guó)Abcam公司)；細(xì)胞增殖活性檢測(cè)CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；外泌體提取試劑盒(美國(guó)System Biosciences公司)；Trizol總RNA抽提試劑盒 (美國(guó)Invitrogen公司)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶[寶生物工程(大連)有限公司]；HPX-9162MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；3K18高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；ZS-3板式酶標(biāo)儀(北京市新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司)；Fusion FX6-XT凝膠化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(法國(guó)Vilber公司)；迷你雙垂直電泳槽、迷你轉(zhuǎn)印電泳槽(北京六一生物科技有限公司)；PRISM 7700實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)儀(美國(guó)ABI公司)；倒置顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.4 含藥血清制備 將20只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、保腎通絡(luò)方低劑量組、保腎通絡(luò)方中劑量組及保腎通絡(luò)方高劑量組，每組5只。保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組大鼠分別予濃度為0.5、1.0、2.0 g/mL的保腎通絡(luò)方顆粒劑藥液灌胃，每次灌胃2 mL，每日2次。正常對(duì)照組大鼠予等容積蒸餾水灌胃。各組大鼠連續(xù)灌胃7 d，末次灌胃后1 h待血藥濃度穩(wěn)定后，通過(guò)腹主動(dòng)脈取血，分離血清，然后將血清56 ℃水浴30 min，最后采用無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，-80 ℃保存。

1.5 細(xì)胞分組及給藥方法

1.5.1 細(xì)胞分組 將永生化小鼠腎小球系膜細(xì)胞分為正常對(duì)照組、高糖對(duì)照組、保腎通絡(luò)方低劑量組、保腎通絡(luò)方中劑量組及保腎通絡(luò)方高劑量組。

1.5.2 給藥方法 將腎小球系膜細(xì)胞放入恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)(37 ℃，5%二氧化碳)，待其生長(zhǎng)至80%融合并且生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，進(jìn)行干預(yù)給藥。正常對(duì)照組細(xì)胞予DMEM低糖培養(yǎng)基+正常對(duì)照組大鼠血清培養(yǎng)，高糖對(duì)照組細(xì)胞予含30 mmol/L葡萄糖的高糖培養(yǎng)基+正常對(duì)照組大鼠血清培養(yǎng)，保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組細(xì)胞分別予高糖培養(yǎng)基+10%的保腎通絡(luò)方低、中、高劑量含藥血清培養(yǎng)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 細(xì)胞增殖活性CCK-8檢測(cè) 首先按照1.5.1中的細(xì)胞分組方法將永生化小鼠腎小球系膜細(xì)胞分為5組，并制成細(xì)胞懸液種植于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照組，保證每孔的細(xì)胞數(shù)目一致。然后按1.5.2給藥方法分別對(duì)5組細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，空白對(duì)照組只加等量培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行增殖活性CCK-8檢測(cè)。向每個(gè)孔板加入10 μL的CCK-8溶液，在37 ℃下孵育2 h，然后將96孔板放入酶標(biāo)儀內(nèi)，在540 nm條件下檢測(cè)各組光密度(OD)值，并對(duì)細(xì)胞增殖活性進(jìn)行比較。細(xì)胞增殖活性=(加藥細(xì)胞OD值/空白對(duì)照組細(xì)胞OD值)×100%。

1.6.2 免疫熒光檢測(cè) 首先按照1.5.1中的細(xì)胞分組方法將永生化小鼠腎小球系膜細(xì)胞分為5組，將消毒好的玻片放入12孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，然后將各組細(xì)胞分別種植于玻片，保證每孔的細(xì)胞數(shù)目一致。然后按1.5.2給藥方法分別對(duì)5組細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后對(duì)各組細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Collagen Ⅳ及FN表達(dá)情況進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。加入4%多聚甲醛進(jìn)行固定，透膜后，加入一定濃度的一抗(Collagen Ⅳ 1∶500，F(xiàn)N 1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜，然后加入相應(yīng)的二抗，37 ℃孵育2 h，DAPI細(xì)胞核染色后，甘油封片，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察Collagen Ⅳ及FN表達(dá)情況，每組隨機(jī)選取15個(gè)視野，采用配套的圖像處理軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度，并對(duì)灰度值進(jìn)行比較。

1.6.3 Real-time PCR檢測(cè) 先按照1.5.1細(xì)胞分組方法將永生化小鼠腎小球系膜細(xì)胞分為5組，然后按1.5.2給藥方法分別對(duì)5組細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)干預(yù)培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后對(duì)各組細(xì)胞Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。首先將細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行收集，離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，將上清液移入10 mL無(wú)菌離心管，在上清液中加入適量的外泌體提取試劑，混勻后4 ℃過(guò)夜(至少12 h)，在1 500 r/min離心30 min，并吸出上清液，然后用1 500 r/min離心法將沉淀離心5 min，吸棄上清液，沉淀即為外泌體。然后對(duì)腎小球系膜細(xì)胞及收集的外泌體總RNA進(jìn)行提取，向樣本中加入5 mL的Trizol，室溫放置5 min，然后加入0.2 mL氯仿，震蕩混勻，保存5～10 min，離心后取出最上層，依次加入預(yù)冷異丙醇、75%焦碳酸二乙酯(DEPC)乙醇，離心后，去除乙醇，加入DEPC處理過(guò)的水溶解沉淀。最后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，Real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增及熒光定量。β-actin為內(nèi)參基因。采用 2-△△CT法進(jìn)行Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192 mRNA表達(dá)的相對(duì)定量分析。每個(gè)基因重復(fù)3次，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖活性比較 見(jiàn)表2。

組 別n細(xì)胞增殖活性(%)正常對(duì)照組3100.00±2.02高糖對(duì)照組3210.87±21.29?保腎通絡(luò)方低劑量組3164.28±19.76△保腎通絡(luò)方中劑量組3152.39±13.28△保腎通絡(luò)方高劑量組3139.87±14.95△

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖對(duì)照組比較，△P<0.05

由表2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，高糖對(duì)照組細(xì)胞增殖活性升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高糖對(duì)照組比較，保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組細(xì)胞增殖活性均降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組組間細(xì)胞增殖活性比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組小鼠腎小球系膜細(xì)胞Collagen Ⅳ及FN表達(dá)的灰度值比較 見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，高糖對(duì)照組Collagen Ⅳ及FN灰度值均升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高糖對(duì)照組比較，保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組Collagen Ⅳ及FN灰度值均降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組組間Collagen Ⅳ及FN灰度值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

組 別nCollagen Ⅳ灰度值FN灰度值正常對(duì)照組1560.12±12.4363.34±16.45高糖對(duì)照組152 143.87±24.59?265.43±26.42?保腎通絡(luò)方低劑量組15154.39±20.17△178.67±19.74△保腎通絡(luò)方中劑量組15132.99±21.38△154.84±22.37△保腎通絡(luò)方高劑量組15112.63±19.07△138.79±21.05△

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖對(duì)照組比較，△P<0.05

2.3 各組小鼠腎小球系膜細(xì)胞Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表4。

組 別nCollagen Ⅳ mRNAFN mRNAmiR-192 mRNA正常對(duì)照組151.00±0.011.00±0.021.00±0.01高糖對(duì)照組152.03±0.16?1.89±0.19?1.97±0.14?保腎通絡(luò)方低劑量組151.52±0.23△1.46±0.21△1.46±0.22△保腎通絡(luò)方中劑量組151.34±0.18△1.36±0.16△1.33±0.17△保腎通絡(luò)方高劑量組151.24±0.15△1.23±0.18△1.26±0.13△

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖對(duì)照組比較，△P<0.05

由表4可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，高糖對(duì)照組Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達(dá)均上調(diào)，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高糖對(duì)照組比較，保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達(dá)均下調(diào)，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組組間Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達(dá)組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

近年來(lái)，隨著糖尿病發(fā)病率的不斷升高，DN的發(fā)病率也逐年增加，且DN的病情發(fā)展往往非常迅速，患者一旦出現(xiàn)腎功能異常，將會(huì)很快進(jìn)入終末期腎病階段，對(duì)患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅[7-8]。DN早期的病理改變主要為腎小球肥大、系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)增生及基底膜增厚等。臨床治療主要以積極控制血糖、血壓，早期使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素受體拮抗劑(ARB)類(lèi)藥物為主，但并不能完全阻斷疾病的進(jìn)展[9]。研究表明，高血糖可刺激并介導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞的活化，促使系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)增多，這也是DN蛋白尿產(chǎn)生及腎小球硬化的重要病理機(jī)制[10-11]。Collagen Ⅳ及FN是細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分。Collagen Ⅳ是一種基膜膠原，是腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，并在系膜細(xì)胞間相互交叉呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[12]。FN作為一種大分子糖蛋白，在細(xì)胞外基質(zhì)中相互交叉，形成網(wǎng)絡(luò)，可為其他細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積提供支架[13]。Collagen Ⅳ及FN水平升高，可明顯促進(jìn)腎組織纖維化[14]。外泌體是一種機(jī)體細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙層膜的微小膜泡，其作為細(xì)胞間通訊的媒介，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、生理學(xué)和病理生物學(xué)等許多方面都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[15]。有研究表明，DN腎小球系膜細(xì)胞外泌體miR-192的表達(dá)明顯上調(diào)，而系膜細(xì)胞異常分泌的外泌體可以進(jìn)入足細(xì)胞并引起足細(xì)胞損傷。因此，外泌體miR-192表達(dá)異常，進(jìn)而介導(dǎo)系膜細(xì)胞活化及足細(xì)胞損傷也可能是DN重要的病理機(jī)制，而抑制系膜細(xì)胞活化，并調(diào)控外泌體miR-192的表達(dá)可有效延緩DN病情進(jìn)展[16-17]。本研究結(jié)果也顯示，與正常對(duì)照組比較，高糖對(duì)照組采用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)后系膜細(xì)胞增殖活性明顯升高(P<0.05)，Collagen Ⅳ及FN的表達(dá)均明顯增多(P<0.05)，Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.05)。

DN屬于中醫(yī)學(xué)水腫、尿濁、關(guān)格等范疇，為本虛標(biāo)實(shí)之證，不同的醫(yī)家對(duì)DN的病因病機(jī)進(jìn)行了不同的闡述。呂仁和等[18]認(rèn)為，DN主要是由于消渴治不得法，傷陰耗氣，痰濁瘀血互相膠結(jié)，積聚于腎絡(luò)，形成微型癥瘕導(dǎo)致，并提出了“微型癥瘕”的病機(jī)學(xué)說(shuō)。南征教授則認(rèn)為，消渴病久者，必然本體大傷，久病致絡(luò)病瘀血，血瘀痰生，熱結(jié)毒生，毒傷腎絡(luò)，腎絡(luò)瘀塞，不能蒸化水液，水液潴留，進(jìn)一步發(fā)展為DN，并提出了“毒損腎絡(luò)”的病機(jī)學(xué)說(shuō)[19]。我們認(rèn)為，DN初期多為氣陰兩虛，陰虛燥熱，繼而出現(xiàn)氣血凝滯，絡(luò)脈閉阻，日久耗傷腎之氣精，導(dǎo)致腎失封藏，精微下泄，“腎氣不足，腎精虧虛，腎失封藏，腎絡(luò)閉阻”是DN發(fā)病的核心病機(jī)，治宜補(bǔ)腎活血通絡(luò)。保腎通絡(luò)方方中熟地黃補(bǔ)腎填精；黃芪健脾益氣；菟絲子滋補(bǔ)肝腎，固精縮尿；劉寄奴、鬼箭羽活血祛瘀通經(jīng)；丹參祛瘀生新，活血調(diào)經(jīng)；水蛭破血利水，達(dá)到血行則水行之效。諸藥合用，共奏益腎填精、活血通絡(luò)之功。本研究結(jié)果顯示，與高糖對(duì)照組比較，保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組含藥血清細(xì)胞增殖活性明顯受到了一定程度的抑制，均明顯降低(P<0.05)，Collagen Ⅳ及FN的表達(dá)均明顯減少(P<0.05)，Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.05)，但保腎通絡(luò)方不同劑量組組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

前期研究表明保通絡(luò)方對(duì)DN模型小鼠足細(xì)胞有保護(hù)作用[6]，并能有效阻止蛋白尿的發(fā)生，延緩疾病進(jìn)展[20]。本研究結(jié)果表明，保腎通絡(luò)方還可以降低DN腎小球系膜細(xì)胞增殖活性，抑制細(xì)胞外基質(zhì)增生，減少Collagen Ⅳ及FN蛋白的表達(dá)，并且能夠下調(diào)Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192 mRNA的表達(dá)，從多途徑對(duì)DN進(jìn)行干預(yù)治療。綜上所述，保腎通絡(luò)方對(duì)DN的防治具有多靶點(diǎn)效應(yīng)。