關(guān)健斌 仇永鋒 楊利學(xué) 梁浩浩

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)2016級碩士研究生，陜西 咸陽 712046)

斷肢再植術(shù)是在顯微鏡下將離斷后的肢體進行斷端重建，其中包括骨骼、肌腱、血管、神經(jīng)等組織對接重建，再通斷肢的血液供應(yīng)，以期最大程度恢復(fù)殘肢生理功能的一類高難度精細(xì)手術(shù)。雖然隨著醫(yī)學(xué)的進步，手術(shù)成功率逐漸提高，但一但失敗則會出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的情況。其中血管危象是斷肢再植術(shù)失敗的主要原因[1]，主要是指顯微外科手術(shù)中對細(xì)小動靜脈吻合后，由于吻合口痙攣或血栓栓塞，進而血運受阻，器官組織血液灌注量不足，甚至出現(xiàn)壞死[2]。因此，處理血管危象的關(guān)鍵是避免吻合端血栓形成，減輕炎性反應(yīng)，抑制體內(nèi)的抗凝機制。

肝素及罌粟堿等在顯微外科手術(shù)中的廣泛應(yīng)用，使得血管危象的發(fā)生率逐年降低，但也存在不可避免的副作用[3]。隨著對水蛭的不斷研究，發(fā)現(xiàn)其所含的水蛭素屬于一種自然的凝血酶抑制劑，是由65個氨基酸殘基組成的一條多肽類物質(zhì)[4-5]。水蛭素可與機體內(nèi)凝血酶的受體在不借助輔助因子的條件下特異性結(jié)合，產(chǎn)生抗凝作用，預(yù)防血管吻合端血栓的形成，促進再植術(shù)后遠端血流的恢復(fù)，從而提高遠端肢體組織的有效灌注量。有研究發(fā)現(xiàn)，天然水蛭素可促進肉芽組織生成，抑制炎癥細(xì)胞對受損組織的浸潤[6-7]。本實驗通過觀察局部外用水蛭素對斷肢再植時吻合端血管通暢率、血栓形成及炎癥細(xì)胞浸潤程度、遠端肢體血流灌注及機體凝血功能的影響，以期尋找一種能提高再植肢體成活率的新型無副作用中藥提取物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康新西蘭白兔48只，雌雄不限，體質(zhì)量(3.0±0.5) kg，購于西安易諾谷生物科技有限公司，動物合格證號：SCXK(陜)2018-0001，于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥協(xié)同創(chuàng)新中心實驗動物房統(tǒng)一飼養(yǎng)，溫度23～25 ℃，濕度50%～70%，飼料由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗試劑 天然水蛭素凍干粉(南寧凈雪皇生物工程有限公司)；肝素鈉注射液(常州千紅生化制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H32022088)；活化部分凝血活酶時間(APTT)測定試劑盒[天津美德太平洋科技有限公司，津食藥監(jiān)械(準(zhǔn)字2010第2400022號)]；纖維蛋白原(FIB)測定試劑盒[上海長島生物技術(shù)有限公司，滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第2401010號]；0.9%氯化鈉注射液(安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H34023607)；碘伏消毒液[山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，魯衛(wèi)消證字(2002)第0059號]；10%水合氯醛溶液(上海山浦化工有限公司)；10%甲醛溶液(上海哈靈生物科技有限公司)；注射用頭孢呋辛鈉(國藥集團威奇達藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20066954)；蘇木素染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 實驗儀器 經(jīng)濟型連續(xù)變倍體視顯微鏡(SZM-7045型，無錫鑫能達科技有限公司)；顯微鏡(BX50型，日本OLYMPUS公司)；高速臺式離心機(TGL-20B型，上海安亭科學(xué)儀器廠)；激光多普勒血流儀(PeriFlux5010型，瑞典Perimed AB公司)；全自動血凝分析儀(C2000-A型，北京普利生儀器有限公司)；電子秤(永康市珠恒電子有限公司)；長毛兔電推剪(T82型，荷蘭皇家飛利浦公司)；石蠟切片機(日本SONY公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將48只新西蘭白兔按照隨機數(shù)字表法分為3組，對照組、肝素鈉注射液組、水蛭素組，每組16只。

1.2.2 模型制備及給藥 分別對新西蘭白兔稱質(zhì)量，使用20 mL無菌醫(yī)用注射器抽取10%水合氯醛溶液，以4.5 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射進行麻醉，之后每小時0.5 mL/kg體質(zhì)量進行麻醉維持。待兔無抵抗力、角膜反射減弱直到消失時，將兔仰臥位展開，置于操作臺上，備皮區(qū)域需稍大于手術(shù)區(qū)域，用長毛兔電推剪將兔左側(cè)后肢及部分腹部毛發(fā)推剪干凈。備皮完成后用碘伏對手術(shù)野進行消毒，采用激光多普勒血流儀探測兔股動脈走行，并用記號筆沿所探測的動脈走行各畫1條長約4 cm的縱行手術(shù)切口標(biāo)記(于腹股溝中點切至股骨中下段)。打開無菌手術(shù)器械包、顯微手術(shù)器械包，穿戴無菌手套、無菌手術(shù)衣，手術(shù)區(qū)域進行常規(guī)消毒及鋪巾，實驗過程完全遵守?zé)o菌原則。根據(jù)之前的手術(shù)畫線，使用無菌手術(shù)刀切開皮膚、淺筋膜直至皮下深筋膜層，用彎鉗鈍性分離肌肉組織，暴露股動脈鞘，然后分離股動脈、股靜脈及股神經(jīng)。由于10%水合氯醛溶液對周圍神經(jīng)的麻醉效果較差，因此分離出股神經(jīng)后，將股神經(jīng)切斷，防止術(shù)中疼痛引起兔體位改變，甚至休克，導(dǎo)致實驗進行困難或失敗。用2個顯微外科動脈夾夾住股動脈近心端和遠心端，阻斷股動脈血運，從中間橫行切斷股動脈(動脈切斷點統(tǒng)一為髂外動脈分叉下端1 cm處)，然后檢查兩斷端是否整齊，并修剪血管外膜。對照組用0.9%氯化鈉注射液，肝素鈉注射液組用肝素鈉注射液62.5 U/mL，水蛭素組用天然水蛭素凍干粉液(5 mg天然水蛭素凍干粉∶100 mL 0.9%氯化鈉注射液)，各150 mL，由兩血管斷端沖洗血管腔。然后用10-0尼龍線行原位斷端吻合術(shù)，保證進針時針尖與血管管壁角度垂直，內(nèi)膜良好對合前進行縫合，并在吻合口最后一針未打結(jié)前，在吻合端處注入相應(yīng)溶液。完全吻合后，再在吻合端局部分別注射上述對應(yīng)3組液體各2 mL，觀察血管通暢情況，確保再植術(shù)模型造模成功，然后用5-0尼龍線逐層縫合傷口。手術(shù)完成后，予注射用頭孢呋辛鈉兔臀大肌注射防止感染。為避免兔之間相互撕咬導(dǎo)致吻合端斷裂或傷亡，術(shù)后每只兔進行單獨分籠飼養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大體觀察 每組術(shù)后即刻取16只兔，術(shù)后24 h取其中8只兔，術(shù)后48 h取余下8只兔，使用20 mL無菌醫(yī)用注射器抽取10%水合氯醛溶液4.5 mL/kg進行腹腔注射麻醉，待兔角膜反射消失后，打開手術(shù)切口，顯露吻合端，在顯微鏡下觀察血管管腔的再通情況、周圍組織粘連程度、吻合端水腫情況等，再進行血管通暢實驗，即用2個顯微外科動脈夾夾住股動脈血管斷端兩側(cè)，將動脈夾所夾血管間的血液排空，然后松開近心端的動脈夾，觀察動脈血管是否充盈。

1.3.2 經(jīng)皮激光多普勒血液灌注檢測 采用激光多普勒血流儀的血液灌注監(jiān)測系統(tǒng)(LDPM)模塊[8]對組織內(nèi)血流灌注量及移動紅細(xì)胞密度(CMBC)平均值進行量化，其值表示的是灌注單位(PU)。術(shù)前將激光多普勒血流儀的Small Straight Probe404探頭接觸每只兔左側(cè)后肢最末端，測定兔左側(cè)后肢末端血運，并用標(biāo)記筆在探測點標(biāo)記，術(shù)后24 h、48 h均在此處測定兔左側(cè)后肢末端血運。探測過程中探頭觸碰組織的同時應(yīng)保持接觸面無壓力，并用儀器匹配的雙面膠布將探頭固定在測定點。探頭另一側(cè)連接計算機，通過自帶軟件得出相關(guān)PU值。

1.3.3 病理組織學(xué)觀察 術(shù)后24 h、48 h進行大體觀察和肢體末端血運測定后，將血管吻合處的血管段切除(長1 cm左右)，用10%甲醛溶液固定24 h，然后進行組織脫水，將切除的血管段取出，于70%、80%、90%、100%乙醇梯度浸泡，每種濃度浸泡30 min，最后再次浸泡于100%乙醇中30 min。然后進行透明，將所取血管段依次浸泡于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各30 min。經(jīng)上述步驟后，進行石蠟浸蠟與包埋，待石蠟?zāi)毯?，將蠟塊取出，對蠟塊進行修正并做標(biāo)記存放。將石蠟包埋好的血管段固定于切片機上，連續(xù)切成4 μm厚度薄片，將切下的血管薄片放于溫水中，然后將其輕輕貼附于防脫載玻片上，再將組織切片進行烤片。接著進行蘇木素-伊紅(HE)染色，具體染色方法如下：將切片進行脫蠟和水化，然后應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min，然后置于蒸餾水中待用。將脫蠟和水化后的組織標(biāo)本完全浸沒蘇木素染液中5 min，然后取出用流水沖洗掉切片上的蘇木素染液，再完全浸于1%鹽酸乙醇溶液中分化脫色，流水再次沖洗切片，然后將切片浸泡入溫水中返藍10 min，再用流水沖洗。將以上切片完全浸于0.5%伊紅染色，進行乙醇梯度脫水(同上)，然后進行透明處理，浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各1 min。最后進行切片的風(fēng)干和封片。在顯微鏡下放大200倍觀察組織細(xì)胞并進行拍照，觀察染色后吻合端周圍炎癥細(xì)胞浸潤與組織壞死程度。然后用Image Pro Plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像處理系統(tǒng)測量血栓占比。

1.3.4 凝血功能檢測 術(shù)前及術(shù)后24 h、48 h，采集每只兔耳緣靜脈血1.8 mL，加入枸櫞酸鈉抗凝劑0.2 mL，進行震蕩混合，充分混勻后，用離心機3 000 r/min，離心10 min。采用全自動血凝分析儀檢測凝血功能指標(biāo)APTT和FIB。

2 結(jié) 果

2.1 3組兔大體觀察 術(shù)后即刻，3組兔血管斷端處輕度滲血但無血凝塊附著于管壁，與周圍組織間無任何粘連，吻合端處輕度腫脹，血管呈淡紅色，血管通暢實驗均為陰性，血管吻合術(shù)后通暢率為100%。術(shù)后24 h，對照組兔血管斷端吻合處血管外壁稍有隆起，部分可見血管斷端吻合處有血凝塊形成，近端較遠端管腔大，血液流速慢，血管通暢實驗為弱陽性。肝素鈉注射液組、水蛭素組兔血管斷端吻合處血管平滑，無血凝塊黏附，血管通暢實驗均為陰性。術(shù)后48 h，對照組兔血管與周圍組織稍有粘連，很難進行游離。血管斷端吻合處縫合線部分顯露，未再通而栓塞，血管內(nèi)看到血凝塊于血管內(nèi)壁附著，吻合端遠端無血流，血管通暢實驗為陽性，管腔由于缺乏血液提供營養(yǎng)而變干。肝素鈉注射液組、水蛭素組兔血管斷端吻合處平滑，無血凝塊黏附，血管與周圍組織均無粘連，血管壁較術(shù)后24 h彈性下降，血管通暢實驗為陰性。

2.2 3組兔術(shù)后即刻及術(shù)后24 h、48 h股動脈血管通暢率比較 見表1。

表1 3組兔術(shù)后即刻及術(shù)后24 h、48 h股動脈血管通暢率比較 %

與對照組比較，*P<0.05；與肝素鈉注射液組比較，△P<0.05

由表1可見，術(shù)后即刻，3組兔股動脈血管通暢率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后24 h、48 h，肝素鈉注射液組、水蛭素組兔股動脈血管通暢率均高于對照組同期(P<0.05)。術(shù)后48 h，水蛭素組兔股動脈血管通暢率高于肝素鈉注射液組同期(P<0.05)。

2.3 3組兔術(shù)后24 h、48 h平均PU值、血栓占比比較 見表2。

對照組術(shù)后24 h(n=8)術(shù)后48 h(n=8)肝素鈉注射液組術(shù)后24 h(n=8)術(shù)后48 h(n=8)水蛭素組術(shù)后24 h(n=8)術(shù)后48 h(n=8)PU值2.20±0.401.20±0.50#4.10±1.50?4.30±1.70△4.30±1.40?4.40±1.40△血栓占比8.12±1.5311.25±2.935.36±1.35?7.36±2.15△5.23±1.12?7.23±1.98△

與對照組術(shù)后24 h比較，*P<0.05；與對照組術(shù)后48 h比較，△P<0.05；與本組術(shù)后24 h比較，#P<0.05

由表2可見，術(shù)后24 h、48 h，肝素鈉注射液組、水蛭素組平均PU值均高于對照組同期(P<0.05)，血栓占比均低于對照組同期(P<0.05)；肝素鈉注射液組與水蛭素組平均PU值、血栓占比比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組術(shù)后48 h平均PU值低于本組術(shù)后24 h(P<0.05)。

2.4 3組兔術(shù)前、術(shù)后24 h、術(shù)后48 h APTT、FIB比較 見表3。

由表3可見，術(shù)后24 h、48 h，肝素鈉注射液組、水蛭素組APTT均高于對照組(P<0.05)，F(xiàn)IB均低于對照組(P<0.05)；肝素鈉注射液組與水蛭素組APTT、FIB比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

對照組術(shù)前(n=16)術(shù)后24 h(n=8)術(shù)后48 h(n=8)肝素鈉注射液組術(shù)前(n=16)術(shù)后24 h(n=8)術(shù)后48 h(n=8)水蛭素組術(shù)前(n=16)術(shù)后24 h(n=8)術(shù)后48 h(n=8)APTT(s)24.21±2.8911.28±1.269.23±0.9523.98±3.2928.52±4.33?33.82±8.01△23.62±3.1929.12±4.67?34.21±7.86△FIB(g/L)2.62±0.604.52±0.536.35±1.542.55±0.743.52±0.82?3.35±0.84△2.46±0.793.43±0.71?3.45±0.87△

與對照組術(shù)后24 h比較，*P<0.05；與對照組術(shù)后48 h比較，△P<0.05

2.5 3組兔術(shù)后24 h、48 h組織病理學(xué)觀察 術(shù)后24 h，與對照組比較，肝素鈉注射液組和水蛭素組均可見新生薄壁血管生成，其中水蛭素組最多。3組均可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，其中對照組炎癥細(xì)胞浸潤最重，水蛭素組炎癥細(xì)胞浸潤情況最輕。術(shù)后48 h，與對照組比較，肝素鈉注射液組和水蛭素組均可見較多的新生薄壁血管形成；對照組炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加，部分細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、壞死，而肝素鈉注射液組和水蛭素組炎癥細(xì)胞浸潤明顯較術(shù)后24 h減少，炎性反應(yīng)較對照組輕。見封3，圖1。

3 討 論

斷肢再植術(shù)后血管危象的成因主要有血管平滑肌收縮導(dǎo)致的血管痙攣。由于傷后情緒刺激導(dǎo)致血管緊張素增多[9]，同時交感神經(jīng)興奮，其末梢釋放大量去甲腎上腺素等化學(xué)遞質(zhì)，引起全身大小動靜脈處于持續(xù)緊張狀態(tài)，造成肢體遠端血流灌注不足，甚至血運消失[10]。另外，疼痛刺激促使受損組織細(xì)胞釋放多重內(nèi)源性致痛物質(zhì)，刺激全身動靜脈引起血管收縮，導(dǎo)致痙攣[11]。血管內(nèi)膜損傷是另一大主要因素，血管內(nèi)膜損傷后，其抗凝血系統(tǒng)平衡被打破，促使內(nèi)膜分泌大量的血栓素B2(TXB2)、內(nèi)皮素，以及降低血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達，造成血管吻合處血栓堆積，從而導(dǎo)致再植術(shù)后遠端肢體血運障礙。肝素鈉主要通過與抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)結(jié)合，而增強后者對活化的凝血因子Ⅱ、Ⅸ、X、Ⅺ和Ⅻ的抑制作用，從而阻止血小板凝集，阻止凝血酶原變?yōu)槟?，抑制纖維蛋白原變成纖維蛋白，發(fā)揮體內(nèi)和體外抗凝作用。已有研究證實，局部應(yīng)用天然水蛭素能降低TXB2、血管內(nèi)皮素(ET)含量，減少血栓形成，提高VEGF的表達，促進新生薄壁毛細(xì)血管形成[12]。由于損傷，損傷部位和周圍組織會合成并釋放大量凝血酶、炎癥因子，從而激活凝血系統(tǒng)和炎性反應(yīng)，產(chǎn)生一系列病理變化，抑制吻合端修復(fù)[13]。天然水蛭素通過抑制凝血酶的相關(guān)信號通路，減少血栓形成，調(diào)節(jié)VEGF與血管生成拮抗因子之間的動態(tài)平衡，抑制炎性反應(yīng)，最終對斷肢再植術(shù)后的血管危象達到預(yù)防作用[14-15]。

本實驗中通過LDPM模塊對組織內(nèi)血流灌注量及CMBC平均值進行量化，即PU值進行比較。結(jié)果顯示，術(shù)后24 h，肝素鈉注射液組、水蛭素組PU值均高于對照組(P<0.05)。術(shù)后48 h，肝素鈉注射液組、水蛭素組PU值穩(wěn)定于術(shù)后24 h水平，而對照組有下降趨勢(P<0.05)。通過大體觀察股動脈血管通暢率，肝素鈉注射液組和水蛭素組術(shù)后24 h、48 h均高于對照組(P<0.05)，且術(shù)后48 h水蛭素組高于肝素鈉注射液組(P<0.05)。說明天然水蛭素可以更長期發(fā)揮與肝素鈉注射液相同的作用，提高吻合血管術(shù)后血管通暢率，有效預(yù)防肢體末端血運障礙。

通過HE染色觀察切片中各炎癥細(xì)胞的浸潤情況，顯示對照組術(shù)后24 h、48 h炎癥細(xì)胞浸潤高于肝素鈉注射液組和水蛭素組；對照組血管吻合端血栓占比高于肝素鈉注射液組和水蛭素組同期(P<0.05)。凝血功能監(jiān)測結(jié)果表明，術(shù)后24 h、48 h對照組APTT均低于肝素鈉注射液組和水蛭素組同期(P<0.05)，F(xiàn)IB均高于肝素鈉注射液組和水蛭素組同期(P<0.05)；而肝素鈉注射液組和水蛭素組趨于正常值，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明水蛭素能通過抑制體內(nèi)凝血機制和降低炎性反應(yīng)來抑制血栓形成。

綜上所述，天然水蛭素具有良好的抑制血管吻合端血栓形成、降低炎性反應(yīng)的作用。通過HE染色觀察，在抑制炎性反應(yīng)的效果上，優(yōu)于肝素鈉注射液組；在預(yù)防血栓形成、抑制凝血系統(tǒng)、恢復(fù)肢體遠端血運的作用上與肝素鈉注射液組相似。說明天然水蛭素既有預(yù)防吻合端血栓形成、抑制凝血系統(tǒng)、恢復(fù)肢體遠端血運的作用，又能抑制炎性反應(yīng)造成的應(yīng)激。