劉貞銀，梁 陽，歐陽軍，鄭丹丹，余榕捷，張華華

免疫衰老是指生物體的免疫系統(tǒng)隨年齡增加而產(chǎn)生的一系列退化、代償和重建。免疫衰老的主要歷程包括初始 T 細胞的耗竭、胸腺的退化、T 細胞受體的基因多態(tài)性消減、記憶/效應(yīng) T 細胞累積及衰老的慢性炎癥狀態(tài)。且胸腺的退化和萎縮是免疫衰老過程中最主要的免疫學(xué)表現(xiàn)，胸腺退化會直接導(dǎo)致胸腺內(nèi)初始T細胞的發(fā)育障礙以及向外周T淋巴細胞輸出減少，從而導(dǎo)致 T 淋巴細胞介導(dǎo)的免疫能力減弱，使機體免疫自穩(wěn)功能紊亂并加快衰老[1]。胸腺的狀態(tài)和功能直接影響機體的免疫功能, 胸腺的萎縮是機體免疫衰老的直接原因[2]。垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP)是一種多功能性神經(jīng)多肽，與其衍生物均具有修復(fù)神經(jīng)損傷、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)、保護神經(jīng)細胞作用；參與 T 淋巴細胞分化、增殖以及調(diào)節(jié)相關(guān)免疫功能和維持機體免疫自穩(wěn)等作用，而這些作用都基于活化的受體刺激細胞內(nèi)第二信使 cAMP 的產(chǎn)生[3]。已有研究[4]表明，PACAP通過與免疫細胞上特定受體結(jié)合，在細胞免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了使其有更好的穩(wěn)定性及穿膜能力，利用基因重組制備技術(shù)重組神經(jīng)肽: 含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domain，PTD) 的重組 PACAP(PACAP-PTD)。它是一種介導(dǎo)大分子跨膜的運載工具，能夠穿透生物膜，介導(dǎo)各種分子在細胞之間自由傳遞，而且對機體細胞沒有明顯不良反應(yīng)[5]。該研究從初始T 細胞耗竭、胸腺退化的角度展開系統(tǒng)研究，探討 PACAP 和 PACAP-PTD 對免疫衰老模型小鼠胸腺功能的影響, 初步明確其延緩免疫衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料半乳糖(北京 Solarbio 公司)；血液/細胞/組織全基因組 DNA 抽提試劑盒(北京天根公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SYBR Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒、TRIzol(美國Invitrogen公司)；Prime ScriptTMRT reagent 試劑盒、TAKARA TaqTMPCR 試劑盒(日本TaKaRa公司)；Anti-mouse CD3-PercpTMCy5.5、CD4-FITC、CD8-PE(美國 BD 公司)；ABI 7500型實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystem 公司)；雄性BALB/c小鼠SPF級，許可證號：SCXK(粵)2011-0015，SPF級動物房飼養(yǎng)(南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)；Real-time PCR測定的引物見表1，由上海生工生物合成。

1.2 方法

1.2.1D-半乳糖(D-Gal)致衰老模型小鼠的建立及生物學(xué)鑒定 6～8 周齡 BALB/c 雄鼠 30 只(18～22 g)隨機分成對照組和模型組，對照組5只小鼠，每天皮下注射生理鹽水(500 mg/kg)；模型組25只小鼠，注射等量 D-Gal 溶液，連續(xù) 42 d。整個實驗中小鼠自由飲水進食。最后一次注射后稱量小鼠體質(zhì)量，摘眼球取血，處死小鼠并稱取脾臟和胸腺重量。胸腺、脾臟指數(shù)(mg/10 g)=臟器重量(mg)/[體質(zhì)量(g)×10]。分別采用黃嘌呤氧化酶法、TBA 比色法測定血清中 SOD 活性和 MDA 含量。

1.2.2Real-time PCR測定衰老小鼠T細胞中sjTREC含量 D-Gal 致衰老小鼠模型18只，隨機分為D-Gal組、PACAP組、PACAP-PTD組，每組6只；PACAP組和PACAP-PTD組分別每天腹腔注射10 nmol/ml PACAP和 PACAP-PTD溶液(12.5 ml/kg)，D-Gal組腹腔注射等量的生理鹽水，連續(xù)注射14 d。

獲取胸腺和脾臟淋巴細胞，抽提基因組DNA，進行Real-time PCR反應(yīng),建立標準曲線,體系反應(yīng)的條件：95 ℃ 2 min去UDG，95 ℃ 3 min預(yù)變性，95 ℃ 30 s，62 ℃ 15 s，進行50個循環(huán)。制備標準以及陽性重組質(zhì)粒。在同1次反應(yīng)中，稀釋標準重組質(zhì)粒反應(yīng)組：108、107、106、105、104、103拷貝/μl，設(shè)置標準質(zhì)粒陰性對照組、TREC片段PCR組、TREC陽性對照組、TREC陰性對照組、RAG2陽性對照組、RAG2片段PCR組，每組均設(shè)置兩個平行重復(fù)。由Real-time PCR反應(yīng)Ct值和標準曲線得出樣本中RAG2和TREC的拷貝數(shù)(copies)，根據(jù)公式：[(TREC copies1 + TREC copies2)/(RAG2 copies1+RAG2 copies2)]×2×106計算出106個細胞中信號結(jié)合T細胞受體(T cell receptor,TCR)重排刪除環(huán)(signal joint T cell receptor rearrangement excision circles，sjTREC)的拷貝數(shù)。

1.2.3real-time PCR檢測衰老小鼠胸腺功能和狀態(tài)相關(guān)基因表達 獲取胸腺和脾臟細胞，抽提淋巴細胞 RNA，設(shè)計并合成引物，設(shè)置 42 ℃除去基因組 DNA，RNA 反轉(zhuǎn)錄成互補 DNA(cDNA)，進行逆轉(zhuǎn)錄real-time PCR反應(yīng)，建立擴增曲線，體系反應(yīng)：95 ℃ 30 s 預(yù)變性1次，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 個循環(huán)。在同 1 次反應(yīng)中，設(shè)置樣品T 淋巴細胞易位蛋白(LIM domain only 2, LMO2)、白細胞介素-7(interleukin-7, IL-7)、叉頭蛋白N1(forkhead box protein N1,Foxn1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehydE-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)片段PCR組和陰性對照組，每組均設(shè)置兩個平行重復(fù)；PCR反應(yīng)完成后設(shè)定閾值，利用軟件輸出Ct值；根據(jù)比較Ct值法得到不同基因表達比率，公式為：2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測小鼠全血中CD3、CD4、CD8 加入100 μl EDTA抗凝血于離心管中，用紅細胞裂解液2 ml，室溫、裂解15 min(1 000 r/min離心5 min)，棄上清液；加入 1 ml PBS 緩沖液洗滌2次(1 000 r/min離心5 min)；用50 μl PBS緩沖液重懸細胞，細胞懸液移入流式管；每管分別加入2.5 μl Anti-mouse CD3-PercpTM Cy5.5、CD8-PE、CD4-FITC混勻，4 ℃避光孵育30 min；PBS洗滌1次，用4%多聚甲醛400 μl混勻固定樣品后，進行FACS Canto Ⅱ流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 D-Gal致衰老小鼠動物模型建立成功

2.1.1小鼠的生物學(xué)行為和一般狀態(tài) 小鼠注射D-Gal 溶液建立衰老模型，連續(xù)注射42 d后小鼠無死亡。與對照組相比，模型組小鼠呈現(xiàn)明顯衰老體征，脊椎漸現(xiàn)隆起，皮膚松弛，體型瘦削，毛發(fā)蓬松直豎且稀疏失去光澤，行動遲緩少動且喜蜷縮，對照組小鼠則無相應(yīng)形態(tài)狀況。見圖 1。

2.1.2小鼠體質(zhì)量及脾臟和胸腺指數(shù)變化 建立模型期間每周稱取小鼠體質(zhì)量，與對照組小鼠比較，模型組小鼠體質(zhì)量增長較慢。根據(jù)主效應(yīng)和交互效應(yīng)方差分析的結(jié)果顯示，不同時間之間體質(zhì)量有差異(F=30.06，P<0.01)；時間與組別之間不存在交互效應(yīng)(F=1.98，P>0.05)；模型組與對照組間體質(zhì)量無差異(F=10.14，P>0.05)。單獨效應(yīng)分析模型組與對照組做兩兩比較，從 35 d起模型組小鼠與對照組相比體質(zhì)量有差異(35 d:t=5.02，P<0.01；42 d:t=6.40，P<0.01)。見圖2。建模完成后，模型組小鼠的胸腺及脾臟指數(shù)均低于對照組 (P<0.01)。見表2。

圖2 模型組與對照組小鼠體質(zhì)量變化

表2 模型組與對照組小鼠胸腺和脾臟重量及指數(shù)的比較

與對照組比較：*P<0.01

2.1.3小鼠血清中SOD活力和MDA含量變化 與對照組比較，模型組小鼠血清中SOD活力下降，MDA含量升高，確定建模成功。見表3。

表3 D-Gal致衰老小鼠血清中SOD活力和MDA含量變化

與對照組比較：*P<0.01

2.2 衰老模型小鼠T細胞中sjTREC含量結(jié)果

2.2.1Real-time PCR反應(yīng) Real-time PCR反應(yīng)后核酸擴增過程中的動力學(xué)曲線呈S型，熔解曲線為單一峰，證明了產(chǎn)物的特異性。見圖3。

2.2.2標準曲線 用梯度稀釋標準質(zhì)粒的Ct值為縱坐標(Y)，標準質(zhì)粒濃度自然對數(shù)為橫坐標(X)，得到一條直線型標準曲線，并獲得一元回歸方程：Y= -3.33X+43.05，斜率為-3.33，R2=0.999。保證了此方法的準確性。見圖4。

2.2.3Real-time PCR測定sjTREC含量的結(jié)果 經(jīng)公式可以計算出各個樣本相同細胞數(shù)目中的TREC copies，從而進行樣本間的比較。Real-time PCR檢測顯示，與D-Gal組比較，PACAP組和PACAP-PTD組胸腺(F=27.24，P<0.01)和脾臟(F=59.90，P<0.01)T淋巴細胞中sjTREC含量上升(P<0.01)。PACAP組和PACAP-PTD組比較，胸腺(P<0.01)和脾臟(P<0.05)中sjTREC含量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖5。

2.3 衰老小鼠胸腺功能和狀態(tài)相關(guān)基因表達結(jié)果

2.3.1Real-time PCR擴增 Real-time PCR反應(yīng)最后可得到反應(yīng)核酸擴增過程的S型動力學(xué)曲線和熔解曲線。擴增曲線呈S型，不同基因表達的熔解曲線為單一峰，證實了產(chǎn)物的特異性。見圖6。

圖3 Real-time PCR結(jié)果

圖4 標準曲線

2.3.2LMO2、Foxn1及IL-7基因表達 Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)與D-Gal組比較，PACAP組和PACAP-PTD組胸腺LMO2基因表達下調(diào)(F=82.962，P<0.01)，IL-7和Foxn1基因表達均上調(diào)(F=348.86，P<0.01；F=219.11，P<0.01)。PACAP-PTD組較PACAP組IL-7和Foxn1基因表達上調(diào)差異大(P<0.01)，LMO2基因的表達下調(diào)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

圖5 Real-time PCR測定胸腺和脾臟淋巴細胞中sjTREC水平

與D-Gal組比較：**P<0.01；與PACAP組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4 小鼠全血中CD3、CD4、CD8變化

2.4.1CD3+CD4+/CD3+CD8+檢測 利用PercpTMCy5.5、FITC、PE 分別標記CD3+、CD4+、CD8+T細胞，流式分析結(jié)果表明PACAP組和PACAP-PTD組小鼠全血中CD3+CD4+T細胞比例均高于D-Gal組；PACAP組CD3+CD8+T細胞比例低于D-Gal組；PACAP-PTD組CD3+CD8+T細胞比例高于D-Gal組。見圖8。

圖6 Real-time PCR 擴增結(jié)果

圖7 Real-time PCR檢測基因LMO2、Foxn1及IL-7的表達結(jié)果

與D-Gal組比較：**P<0.01；與PACAP組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4.2流式細胞儀檢測全血中CD3+CD4+/CD3+CD8+比值結(jié)果 與D-Gal組比較，PACAP組和PACAP-PTD組CD3+CD4+/CD3+CD8+比值均上調(diào)(F=13.88，P<0.01)。而PACAP組和PACAP-PTD組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖 9。

圖8 CD3、CD4、CD8 T細胞表型變化

A:D-Gal組CD3+CD4+T細胞含量；B:D-Gal組CD3+CD8+T細胞含量；C:PACAP組CD3+CD4+T細胞含量；D:PACAP組CD3+CD8+T細胞含量；E:PACAP-PTD組CD3+CD4+T細胞含量；F:PACAP-PTD組CD3+CD8+T細胞含量

圖9 流式細胞儀檢測全血中CD3+CD4+/CD3+CD8+比值

3 討論

胸腺作為機體重要的中樞免疫器官，是T淋巴細胞分化、發(fā)育、成熟和輸出至外周T淋巴細胞庫的場所，因此初始T細胞的數(shù)目可以評價胸腺T淋巴細胞生成和輸出功能。而sjTREC是在TCRα基因重組過程中，在TCRδ基因兩側(cè)的刪除片段δRec和ψJα之間重組形成一個環(huán)狀DNA分子而被刪除，其含量在胸腺組織近期產(chǎn)生的T淋巴細胞群體中最高，在細胞中穩(wěn)定存在且不隨細胞分裂而復(fù)制，能夠代表形成功能性TCR時初始T細胞的數(shù)量。因此，檢測sjTRECs的含量能真實的評價胸腺的輸出功能狀態(tài)，現(xiàn)已成為基礎(chǔ)和臨床研究中重要的胸腺功能免疫學(xué)指標[6]。D-Gal誘導(dǎo)的衰老模型是目前較經(jīng)典的衰老動物模型，接近于自然衰老規(guī)律[7]。本研究成功建立D-Gal致免疫衰老小鼠模型，胸腺功能發(fā)生破壞性降低。本研究中,PACAP組和PACAP-PTD組小鼠胸腺和脾臟的初始T細胞的數(shù)量較D-Gal組均增加，表明胸腺的生成和輸出功能均提高,向外周T淋巴細胞輸出增多，維持外周T細胞受體庫多樣性。證實PACAP和PACAP-PTD可以保護胸腺器官的功能性，恢復(fù)退化的胸腺功能，延緩胸腺相關(guān)的免疫衰老。同時，PACAP-PTD較PACAP對胸腺初始T細胞生成和輸出能力更有效。

胸腺退化是機體衰老的重要生物學(xué)標志，過程涉及復(fù)雜的基因表達變化。胸腺的各種功能主要是由胸腺微環(huán)境調(diào)節(jié)和顯現(xiàn)的。胸腺微環(huán)境主要由胸腺細胞和胸腺上皮細胞組成，并為細胞發(fā)育提供關(guān)鍵的細胞因子同時還可能對胸腺選擇有著調(diào)控與支持的作用。LMO2是一種T細胞原癌基因，蛋白質(zhì)的過度高水平表達會導(dǎo)致T淋巴細胞過度增殖[8]。IL-7是胸腺早期維持T細胞的生長因子，確保胸腺T細胞增加輸出到外周庫，延緩胸腺萎縮和增強免疫反應(yīng)[9]。Foxn1轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)胸腺上皮細胞發(fā)育的主要因子，其低表達會促進胸腺萎縮和免疫缺陷[10]。因此選擇以上幾個胸腺微環(huán)境相關(guān)的基因進行分析，進而有效的評價小鼠胸腺的狀態(tài)和功能。本研究中，PACAP組和PACAP-PTD組小鼠Foxn1基因上調(diào)，表明小鼠胸腺微環(huán)境中的胸腺上皮細胞活性和功能增強，胸腺微環(huán)境受到保護；IL-7基因上調(diào)可維持胸腺功能性和穩(wěn)定狀態(tài)，保護胸腺微環(huán)境，增加外周T細胞的輸出；而其負調(diào)控因子基因LMO2表達下調(diào)，表示胸腺細胞在發(fā)育過程當中受負調(diào)控影響下降，胸腺細胞可正常發(fā)育。證實PACAP和PACAP-PTD可以使退化的胸腺功能得以回復(fù)，扭轉(zhuǎn)胸腺萎縮，延長細胞免疫功能。

胸腺經(jīng)過對T細胞的馴化、選擇建立機體自身免疫耐受和維持免疫自穩(wěn)。而T細胞亞群首要有CD3+CD4+的輔助性T細胞和CD3+CD8+的細胞毒性T細胞等，CD4+T細胞是協(xié)調(diào)B細胞產(chǎn)生抗體；CD8+T細胞則是抑制抗體合成、分泌及T淋巴細胞的增殖，它們的穩(wěn)態(tài)維持機體日常的免疫應(yīng)答。T細胞亞群可反映機體細胞免疫的水平，是目前臨床上較常用的反映免疫功能狀態(tài)的指標[11]。本研究中PACAP組和PACAP-PTD組小鼠全血中CD3+CD4+T細胞比例升高，表明調(diào)控免疫反應(yīng)最重要的樞紐細胞增多；CD3+CD8+T細胞比例降低，表明免疫反應(yīng)中直接殺傷性細胞減少；CD3+CD4+/CD3+CD8+比值反映機體T細胞亞群的狀態(tài)，比值升高表明機體T淋巴細胞免疫功能增加。證實PACAP和PACAP-PTD具有調(diào)節(jié)機體免疫功能，維持免疫平衡的作用。

總之，本研究以D-Gal致免疫衰老小鼠為模型，探討PACAP和PACAP-PTD通過延緩模型小鼠胸腺的萎縮,調(diào)節(jié)機體細胞免疫功能而發(fā)揮延緩衰老和免疫保護的作用。其中，PACAP和PACAP-PTD改變了退化的胸腺功能狀態(tài)與微環(huán)境，從多個指標的檢測中體現(xiàn)了其延緩衰老和調(diào)節(jié)細胞免疫功能作用。因此，闡明PACAP和PACAP-PTD延緩衰老小鼠胸腺萎縮的作用機制可望成為相關(guān)免疫衰老疾病的治療或輔助治療藥物。