呂 劍，鐘哲峰

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種常見臨床疾病，主要表現(xiàn)為氣促伴或不伴咳嗽、反復(fù)發(fā)作的喘息[1]。以往有研究[2]表明，輔助性T1/2細(xì)胞(Thelper1/2,Th1/Th2)細(xì)胞在哮喘發(fā)病中起著重要作用，而Th2 細(xì)胞的分化發(fā)展是其發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)。大量研究[3]表明，急慢性哮喘發(fā)病過程中Notch 信號(hào)通路與 Th1/Th2 共同參與調(diào)控，但其機(jī)制仍有待明確。人胎盤來源干細(xì)胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells，hPMSCs)是具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)，hPMSCs的致瘤性實(shí)驗(yàn)呈陰性，具有正常的染色體核型，這說明遺傳性狀穩(wěn)定，使其在治療免疫疾病方面有廣闊前景。現(xiàn)建立哮喘大鼠模型，在移植hPMSCs后通過HE染色、RT-qPCR和Western blot等方法觀察其對(duì)哮喘大鼠肺組織的影響，以及調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路表達(dá)，為哮喘治療提供可能的新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雌性大鼠30只(6～8周)，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量(185±12.5)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證[SCXK(湘)2018-0016]，單位使用許可證編號(hào)：SYXK(湘)2015-0033。大鼠統(tǒng)一飼養(yǎng)在南華大學(xué)動(dòng)物房，室溫18～26 ℃，40%～70%相對(duì)濕度，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本研究通過我院倫理委員會(huì)審查，實(shí)驗(yàn)過程動(dòng)物符合3R原則。

1.2 儀器與試劑胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)；低糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó) HyClone 公司)；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；卵白蛋白(Ovalbumin，grate Ⅱ、Ⅴ)(美國(guó)Sigma公司)；SYBR Green 熒光試劑盒(美國(guó) Biomiga公司)； Jagged1兔抗大鼠單克隆抗體(美國(guó)SANTA CRUZ公司)；Notch1、2、3、4 兔抗大鼠單克隆抗體(美國(guó)Cell signaling公司)；圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)；酶標(biāo)檢測(cè)儀(美國(guó)GeneCore公司)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1hPMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 取足月剖宮產(chǎn)胎兒胎盤側(cè)組織，經(jīng)PBS多次沖洗去除血跡，剪成1×1×1 mm3，0.1% Ⅳ型膠原酶中，37 ℃消化30 min，200目篩網(wǎng)過濾收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液離心后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)，7 d后首次全量換液棄去未貼壁細(xì)胞，以后每3 d換液1次，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時(shí)傳代培養(yǎng)。取第 3 代 hPMSCs 消化分離，收集細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/ml )，加入不同 EP管中，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hPMSCs表面標(biāo)志物CD90、CD45、CD44、CD29、CD34。

1.3.2哮喘模型的建立及分組 大鼠隨機(jī)均分為3組，即對(duì)照組、哮喘模型組(OVA組)及hPMSCs 移植組(hPMSCs組)。造模第1天腹腔注射1 ml OVA混懸液致敏(200 mg 氫氧化鋁，V級(jí)OVA 1 mg溶于1 ml生理鹽水)，1周后加強(qiáng)致敏1次，將大鼠置于霧化吸入箱，每天霧化30 min/次(1%的Ⅱ級(jí)OVA 霧化液)，共7次，制作出SD大鼠哮喘模型[4]。其余組均按相同造模方法，對(duì)照組采用生理鹽水進(jìn)行致敏和激發(fā)。而hPMSCs組在首次激發(fā)后，將第 3 代的hPMSCs尾靜脈注入1 ml細(xì)胞混懸液(密度為1×107個(gè)/ml)。對(duì)照組和OVA組采用尾靜脈注射1 ml PBS溶液。

1.3.3肺組織HE染色 各組大鼠取左側(cè)一葉肺組織，石蠟包埋，做厚度4 μm的連續(xù)切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色后，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察病理改變。

1.3.4ELISA法檢測(cè)大鼠血清中免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)、白細(xì)胞介素-4(interleukin 4, IL-4)和干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)含量 末次激發(fā)24 h后，20%烏拉坦腹腔麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，置于抗凝離心管內(nèi)，3 000 r/min離心10 min，分取血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩０凑誆LISA試劑盒說明書檢測(cè)大鼠血清中IgE、IL-4和IFN-γ含量。

1.3.5RT-qPCR法檢測(cè)大鼠肺組織中Notch信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá) 取凍存大鼠肺組織50 mg，TRIzol試劑提取總RNA，根據(jù) Revertaid First Strand CDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，保存在-80 ℃。采用上海生工生物技術(shù)公司合成的Notch1、Notch2、Notch3及Jagged1的引物序列，參照SYBR Green熒光PCR試劑盒說明書，配置反應(yīng)體系，依次進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最后由軟件計(jì)算并讀出各組Ct值，并對(duì)照組基因表達(dá)設(shè)為1，采用2-△△Ct法計(jì)算目的mRNA的含量。

1.3.6Western blot檢測(cè)肺組織中Notch1、Notch2、Notch3及Jagged1蛋白變化 每組取凍存大鼠肺組織100 mg，用預(yù)冷的蛋白裂解液提取總蛋白，1 200 r/min離心5 min，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔以50 μg蛋白樣品上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜，然后脫脂奶粉室溫下封閉2 h，加入Notch1(1 ∶ 200)、Notch2(1 ∶ 200)、Notch3(1 ∶ 200)、Jagged1(1 ∶ 500)一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶ 1 000)室溫孵育1 h，ECL染色后，曝光、顯影。

2 結(jié)果

2.1 hPMSCs培養(yǎng)與鑒定培養(yǎng)7 d后可見梭型細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)增多，培養(yǎng)21 d左右細(xì)胞大量增殖，呈漩渦狀生長(zhǎng)，見圖1。培養(yǎng)3代后的細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析表面標(biāo)記的陽性率為CD44+[(94.11±1.44)%]、CD90+[(97.85±2.75)%]、CD29+[(92.17±2.16)%]，陰性率為CD34-[(92.23±1.68)%]和CD45-[(95.19±2.47)%]。見圖2。

圖1 顯微鏡下觀察hPMSCs形態(tài) ×100

2.2 肺組織病理改變采用倒置顯微鏡觀察拍照，對(duì)照組未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁完整、支氣管無任何改變，而OVA組存在嚴(yán)重炎性改變，支氣管黏膜增厚，管腔狹窄，說明哮喘模型制備成功； hPMSCs組管腔輕微縮窄，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，病理改變較OVA組好轉(zhuǎn)。見圖3。

圖2 流式細(xì)胞儀鑒定hPMSCs

圖3 各組大鼠肺組織學(xué)結(jié)構(gòu) HE×200

圖4 大鼠血清中炎性因子表達(dá)

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與OVA組比較：#P<0.05

2.3 ELISA檢測(cè)大鼠血清炎癥細(xì)胞因子OVA組血清中IgE、IL-4含量高于對(duì)照組(F=77.41，P<0.05；F=37.25，P<0.05)，而與OVA組比較， hPMSCs組血清中IgE、IL-4含量下降(F=28.39，P<0.05；F=14.81，P<0.05)；OVA組血清中IFN-γ含量低于對(duì)照組(F=58.10，P<0.05)，而與OVA組比較， hPMSCs組血清中IFN-γ含量上升(F=155.23，P<0.05)。見圖4。

2.4 大鼠肺組織中Notch1、Notch2、Jagged1 mRNA表達(dá)變化OVA組肺組織中Notch1、Notch2、Jagged1 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(F=56.20，P<0.05)，而與OVA組比較，hPMSCs組Notch1、Notch2、Jagged1 mRNA表達(dá)水平下降(F=64.12，P<0.05)；OVA組Notch3 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)，而與OVA組比較，hPMSCs組Notch3 mRNA表達(dá)水平上升(P<0.05)。見圖5。

2.5 Western blot檢測(cè)大鼠肺組織中Notch相關(guān)蛋白表達(dá)水平OVA組肺組織中Notch1、Notch2、Jagged1 蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組(F=77.46，P<0.05)，而與OVA組比較，hPMSCs組Notch1、Notch2、Jagged1蛋白表達(dá)水平下降(F=105.18，P<0.05)；OVA組Notch3蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，而與OVA組比較，hPMSCs組Notch3蛋白表達(dá)水平上升。見圖6。

圖5 大鼠肺組織中Notch相關(guān)mRNA表達(dá)水平

A：Notch1相對(duì)表達(dá)水平；B：Notch2相對(duì)表達(dá)水平；C：Notch3相對(duì)表達(dá)水平；D：Jagged1相對(duì)表達(dá)水平；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與OVA組比較：#P<0.05

3 討論

哮喘是一種呼吸系統(tǒng)的異質(zhì)性疾病，表現(xiàn)為氣道炎癥導(dǎo)致持續(xù)性氣道高反應(yīng)性下出現(xiàn)的廣泛而可逆性氣道狹窄。哮喘氣道炎癥由多種細(xì)胞因子、黏附分子和炎癥介質(zhì)參與，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等[5-6]。有研究[7-8]表明，Th1/Th2失衡可引起支氣管哮喘，Th1輔助細(xì)胞為 CD4+細(xì)胞，分泌 IL-2、IFN-γ等對(duì)哮喘有一定的抑制作用，還能促進(jìn)IgG的生成。Th2輔助細(xì)胞的主要執(zhí)行細(xì)胞因子為IL-4、IL-5等，能對(duì)抗細(xì)胞外多細(xì)胞寄生蟲的免疫反應(yīng)，另外IL-4、IgE會(huì)活化肥大細(xì)胞而釋放組胺、血清素等，造成氣道收縮[9]。

hPMSCs是來源于胎盤組織的新MSCs，較其他來源MSCs抗炎能力更強(qiáng)，具備有多向分化潛能及免疫調(diào)節(jié)功能[10-11]。hPMSC具有多分化潛能，是一種理想的組織工程種子細(xì)胞。不同來源的MSCs生物學(xué)特性不盡相同，如骨髓來源MSC造血能力極強(qiáng)，臍血來源MSC有強(qiáng)的向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能，胎盤來源MSC在免疫調(diào)控方面更優(yōu)。由于hPMSCs具有低免疫原性[12]及免疫調(diào)節(jié)作用，它可向損傷或炎癥部位遷移發(fā)揮修復(fù)、炎癥抑制作用。研究[13]顯示，hPMSCs較其他MSCs有更強(qiáng)的遷移能力，靶向治療作用更明顯，有著更廣闊的應(yīng)用前景。

HE染色顯示，OVA組存在嚴(yán)重炎性改變，支氣管黏膜增厚，管腔狹窄，這說明哮喘模型制備成功。hPMSCs組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，黏液分泌下降，氣道平滑肌增殖減弱，這說明hPMSCs能緩解哮喘發(fā)展，減輕哮喘誘發(fā)的支氣管炎癥、細(xì)胞浸潤(rùn)的產(chǎn)生；IFN-γ及IL-4分別是Th1和Th2類細(xì)胞的代表性細(xì)胞因子，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與OVA組比較，hPMSCs組血清中IgE、IL-4含量下降(P<0.05)，而IFN-γ含量上升(P<0.05)。這說明hPMSCs能夠抑制哮喘大鼠炎性細(xì)胞因子的分泌和IgE的生成，與HE檢測(cè)結(jié)果基本一致。

圖6 大鼠肺組織中Notch相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與OVA組比較：#P<0.05

Notch信號(hào)通路是一個(gè)在進(jìn)化上十分保守的跨膜受體蛋白家族，在許多疾病過程中起到重要的作用[14]。一個(gè)完整的Notch信號(hào)通路包括 Notch受體、 Notch配體及其下游分子[15]，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用。在哺乳類動(dòng)物中存在有4種Notch受體(Notch1～ 4)及5種配體(Serrate家族配體：Jagged-1、2和Delta家族配體：Delta-1、3、4)。Notch配體能與細(xì)胞表面的Notch受體相互調(diào)節(jié)，激活Notch信號(hào)通路，調(diào)節(jié)外周T淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞和邊緣區(qū)B細(xì)胞等，并參加細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)。哮喘發(fā)病的主要特征為活化的T細(xì)胞分泌過多的Th2類細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13等)，而Th1 細(xì)胞減少，導(dǎo)致Th1/Th2 失衡，產(chǎn)生包括氣道重塑、氣道高反應(yīng)性、黏蛋白分泌過多和氣道炎癥等癥狀。研究[16]證明Notch信號(hào)通路參與Th1、Th2細(xì)胞的增殖、分化過程，阻斷 Notch信號(hào)將影響Th1、Th2細(xì)胞應(yīng)答。Jagged蛋白可誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化，而IFN-γ 能抑制 Th2 細(xì)胞的分化和功能。本實(shí)驗(yàn)RT-qPCR和Western blot結(jié)果表明，與OVA組比較，hPMSCs組Notch1、Notch2、Jagged1 mRNA及蛋白表達(dá)水平下降，而Notch3 mRNA及蛋白表達(dá)水平上升。這提示Notch信號(hào)通路在哮喘發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，同時(shí)hPMSCs可能通過抑制Notch受體(Notch1、Notch2)和配體(Jagged1)表達(dá)，上調(diào)Notch3表達(dá)產(chǎn)生影響，改善哮喘氣道炎癥，而哮喘發(fā)生時(shí)Notch3表現(xiàn)為抑制作用，這與Maekawa et al[17]報(bào)道基本一致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制出哮喘大鼠模型，采用hPMSCs治療后改善哮喘大鼠肺部病理癥狀，hPMSCs可能通過Notch通路的調(diào)節(jié)作用，降低IL-4、IgE水平和增加IFN-γ，減輕氣道高反應(yīng)性和炎癥。目前的研究為將來進(jìn)一步探討hPMSCs與哮喘之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，hPMSCs可能成為治療哮喘的新思路。