梁 雪，呂 磊，錢立庭，李 明，韓丹丹

肺癌是全球癌癥死亡原因之一,近十幾年,它的發(fā)生率與病死率一直穩(wěn)居所有癌癥的榜首[1],而小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)多年來約占整個(gè)肺癌的10%～15%[2],相比較非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，它的惡性程度高、增殖時(shí)間短、病情發(fā)展快，且更容易轉(zhuǎn)移[3]，目前化療仍然是SCLC最主要治療手段之一，5年生存率不足10%,其中多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)產(chǎn)生就是SCLC治療中遇到的最大困窘[4]。

miRNAs是一種保守的、約19～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，有關(guān)專家估算miRNAs至少可以調(diào)控3/5編碼的基因[5]，研究[6]已經(jīng)證明miRNAs在癌癥的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程發(fā)揮著極其重要的作用。近幾來，如Xu et al[7]報(bào)道了miR-146a-5p在雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Liu et al[8]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中FOXP3通過調(diào)控miR-146a-5p過表達(dá)發(fā)揮抑癌的作用。Yuwen et al[9]認(rèn)為血清外泌體miR-146a-5p可作為預(yù)測(cè)順鉑(cisplatin,CDDP)治療肺癌療效和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)耐藥的新的生物學(xué)標(biāo)志物。以往對(duì)肺癌耐藥miRNAs的研究主要集中在NSCLC耐藥相關(guān)miRNAs的檢測(cè)和表達(dá)研究,如Zhang et al[10]發(fā)現(xiàn) miR-181c通過Wnt信號(hào)通路靶向調(diào)控WIF1促進(jìn) NSCLC對(duì)鉑類耐藥；Kwon et al[11]發(fā)現(xiàn)miRNA-128通過靶向BRM270抑制NSCLC耐藥形成。但關(guān)于miR-146a-5p在SCLC中的研究尚未見報(bào)道，因此,臨床需要可靠的預(yù)測(cè)SCLC耐藥的標(biāo)志物，為克服SCLC耐藥提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞系 本研究所用SCLC 耐藥細(xì)胞株(H69-AR)和敏感細(xì)胞株(H69)均來自中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。H69-AR細(xì)胞株培養(yǎng)于含20% FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中；H69為懸浮細(xì)胞株培養(yǎng)于含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中；2種細(xì)胞株均放置在37 ℃、5% CO2, 飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，H69-AR細(xì)胞株每天換液1次，H69細(xì)胞株每3～4 d換液1次。

1.1.2主要試劑 miRNA的qRT-PCR試劑盒(Buige-LoopTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit)以及mRNA的qRT-PCR試劑盒(riboSCRIPTTMmRNA qRT-PCR Starter Kit) 均購(gòu)自中國(guó)廣州銳博生物科技公司，批號(hào)：201906060008；has-miR-146a-5p inhibitor、has-miR-146a-5p mimic、has-miR-146a-5p negative control均購(gòu)自上海吉瑪有限公司；慢病毒滴度均為5×109TU/ml購(gòu)自上海制藥有限公司；一抗兔抗白介素受體1相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor-related kinase 1，IRAK1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-related factor 6，TRAF6)、GAPDH均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；二抗為抗兔IgG-HRP購(gòu)自上海碧云天生物公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海貝博生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器 PCR儀(上海ABI公司)；qRT-PCR儀(加拿大Funglyn Biotech 公司)；熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)ThermoFisher公司)；超凈化工作臺(tái)(深圳創(chuàng)美實(shí)業(yè)有限公司)；全自動(dòng)Western blot成像工作站、電泳儀(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1miRNA qRT-PCR 細(xì)胞中總的RNA是用TRIzol提取,按照廣州銳博生物科技公司生產(chǎn)的miRNA試劑盒(Buige-LoopTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit )說明書進(jìn)行10 μl體系反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃、60 min→70 ℃、10 min；然后繼續(xù)使用miRNA試劑盒進(jìn)行20 μl體系miRNA qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?×95 ℃、10 min→40×95 ℃、2 s；60 ℃、20 s；70 ℃、10 s(收集信號(hào))→1×(70～95) ℃(熔解曲線分析)；反應(yīng)引物合成序列為：

miR-146a-5p ForwardPrimer 5′-GGGTGAGAACT GAATTCCA-3′,ReversePrimer 5′-CAGTGCGTGTCGT GGAGT; U6 snRNA ForwardPrimer 5′-TCCGATCGT GAAGCGTTC-3′，ReversePrimer 5′-GTGCAGGGTCCG AGGT-3′；相對(duì)表達(dá)用U6(small nuclear RNA，snRNA)作參照,結(jié)果用2-△△Ct值表示。

按照廣州銳博生物科技公司生產(chǎn)的mRNA試劑盒(riboSCRIPTTMmRNA qRT-PCR Starter Kit)進(jìn)行10 μl體系反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃、60 min；70 ℃、10 min; 然后繼續(xù)使用mRNA試劑盒進(jìn)行20 μl體系mRNA qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?×95 ℃、10 min→40×95 ℃、5 s；60 ℃、30 s；72 ℃、30 s(收集信號(hào)); 反應(yīng)引物合成序列為：

IRAK1 Forward Primer 5′-CCTGGAAGGCAGA AAAGTTGG-3′，Reverse Primer 5′-CGCAAGAGGACA CTCGGTTAC-3′;TRAF6 Forward Primer 5′-GAACAC CCAGTCACACATGAGAA-3′;Reverse Primer 5′-GAA ATTCCGGACCTCTGAGATATAC-3′，GAPDH Forward Primer 5′-GAACGGGAAGCTCACTGG-3′,Reverse Primer 5′-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3′；相對(duì)表達(dá)用GAPDH作為參照，相對(duì)結(jié)果用2-△△Ct值表示。

1.2.2構(gòu)建慢病毒載體 根據(jù)GenBank中檢索到的序列，委托上海吉瑪有限公司合成：has-miR-146a-5p inhibitor：AACCCATGGAATTCAGTTCTCA;has-miR-146a-5p mimic：TGAGAACTGAATTCCATGGGTT;has miR-146a-5p negative control(NC) ：TTCTCCGAAC GTGTCACGT。

1.2.3H69-AR細(xì)胞株慢病毒轉(zhuǎn)染 分H69-AR NC(對(duì)照組)和 H69-AR mimic(實(shí)驗(yàn)組)；以每孔2×105個(gè)/ml、含20% FBS RPMI1640完全培養(yǎng)基接種于24孔板中，24 h后，用miR-146a-5p mimic或miR-146a-5p NC(1×109TU/ml)慢病毒載體按1 ∶100與含20% FBS RPMI1640完全培養(yǎng)基混合稀釋轉(zhuǎn)染；利用qRT-PCR和熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的H69-AR mimic細(xì)胞株及H69-AR NC細(xì)胞株。

1.2.4H69細(xì)胞株慢病毒載體轉(zhuǎn)染 分H69 NC(對(duì)照組)和H69 inhibitor(實(shí)驗(yàn)組),配制成每孔4×105個(gè)/ml細(xì)胞數(shù)、終濃度5 μg/ml Polybrene、 miR-146a-5p inhibitor或miR-146a-5p NC(1×109TU/ml)慢病毒原液按1 ∶ 20與含有10% FBS RPMI1640完全培養(yǎng)基混合稀釋轉(zhuǎn)染；應(yīng)用qRT-PCR和熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的H69 inhibitor細(xì)胞株及H69 NC細(xì)胞株。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后H69-AR mimic和H69-AR NC都稀釋成5×105個(gè)/ml懸液500 μl分別加入24孔板，待細(xì)胞貼壁鋪滿皿底約70%時(shí), 用10 μl槍頭在單層細(xì)胞呈“一”字型垂直于24孔板內(nèi)表面劃豎線，倒置顯微鏡下拍照，之后用不含有小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)24、48 h,在同一位置,熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6CCK-8細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞抑制率 以每孔2×105個(gè)/ml 100 μl加入96孔板中，每孔分別加入10、20、40、80、100 μg/ml不同濃度的CDDP，另設(shè)對(duì)照組(有細(xì)胞+CCK8,不加藥物)和空白對(duì)照組(無細(xì)胞+CCK8,不加藥物)。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后加入CCK-8試劑10 μl混勻，再培養(yǎng)1～4 h后,最后室溫下使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度(optical density,OD)值。計(jì)算CDDP對(duì)細(xì)胞的抑制率：抑制率=(對(duì)照組OD值-加藥組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.7Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-146a-5p對(duì)靶基因的調(diào)控 提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總蛋白,使用上海碧云天生物科技公司BCA試劑盒對(duì)總蛋白定量，制作10%分離膠和5%濃縮膠，取20 μl總蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉；PVDF膜分別與一抗兔抗IRAK1、TRAF6、GAPDH(1 ∶ 1 500)搖床上4 h；與二抗抗兔IgG-HRP(1 ∶ 2 000)室溫下1 h；全自動(dòng)Western blot成像顯影拍照，Gel-Pro軟件分析灰度結(jié)果，以GAPDH作為蛋白內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 H69-AR和H69細(xì)胞株中miR-146a-5p的表達(dá)比較通過qRT-PCR檢驗(yàn)H69-AR和H69細(xì)胞株中miR-146a-5p的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，H69-AR相比H69細(xì)胞株中miR-146a-5p的表達(dá)下調(diào)(22.71 ∶ 1.00)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，t=10.66)。見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)miR-146a-5p H69與H69-AR的表達(dá)

與H69-AR比較：**P<0.01

2.2 IRAK1和TRAF6是miR-146a-5p潛在的靶基因查閱了大量文獻(xiàn)以及應(yīng)用目前公認(rèn)的TargetScan生物學(xué)軟件進(jìn)行分析，初步選定IRAK1、TRAF6為miR-146a-5p潛在的靶基因。通過qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，H69-AR細(xì)胞中mIRAK1、mTRAF6的表達(dá)水平與H69比較上調(diào)(4.92 ∶1.00)、(2.76 ∶ 1.00)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，t=19.03)、(P<0.05，t=3.75)，見圖2A、B。慢病毒轉(zhuǎn)染成穩(wěn)定H69-AR mimic，見圖2C、D。以及轉(zhuǎn)染成穩(wěn)定H69 inhibitor，見圖2E、F。轉(zhuǎn)染H69-AR mimic后細(xì)胞中mIRAK1、mTRAF6的表達(dá)水平與對(duì)照組(H69-AR NC)比較下調(diào)(1 ∶ 00 ∶ 14.55)、(1 ∶ 00 ∶ 3.20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，t=12.38)、(P<0.01，t=4.24)，見圖3A、B。H69 inhibitor細(xì)胞中mIRAK1、mTRAF6的表達(dá)水平與對(duì)照組(H69NC)比較上調(diào)(10.86 ∶ 1.00)、(4.64 ∶1.00)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，t=16.62)、(P<0.01，t=4.77)，見圖3C、D。

2.3 CCK-8細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-146a-5p對(duì)CDDP在SCLC中的抑制率CCK-8實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞抑制和增殖情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同濃度CDDP的H69組均高于H69-AR組的細(xì)胞抑制率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4A。為了進(jìn)一步檢測(cè)miR-146a-5p對(duì)CDDP的影響，向轉(zhuǎn)染后H69-AR mimic、H69-AR NC、H69 inhibitor、H69 NC的細(xì)胞中加入不同濃度的CDDP，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度 CDDP的H69-AR mimic組均高于對(duì)照組NC的細(xì)胞抑制率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4B。不同濃度CDDP的H69 inhibitor組均低于NC組的細(xì)胞抑制率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4C。此結(jié)果說明miR-146a-5p抑制SCLC對(duì)CDDP的耐藥。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察miR-146a-5p對(duì)SCLC細(xì)胞遷移的影響轉(zhuǎn)染后H69-AR mimic細(xì)胞和NC細(xì)胞，用不含有小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24、48 h后熒光顯微鏡下拍照，H69-AR mimic組與NC組比較遷移速率明顯減緩，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-146a-5p對(duì)IRAK1、TRAF6蛋白表達(dá)的影響通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后IRAK1、TRAF6蛋白表達(dá)情況。見圖6。H69-AR mimic與NC比較細(xì)胞中IRAK1、TRAF6蛋白表達(dá)均下調(diào)；H69 inhibitor與NC比較細(xì)胞中IRAK1、TRAF6的表達(dá)水平均上調(diào)。

圖2 mIRAK1、mTRAF6分別在H69-AR和H69細(xì)胞中的差異表達(dá)和has-miR-146a-5p慢病毒分別在H69-AR和H69細(xì)胞中轉(zhuǎn)染情況

A：mIRAK1在H69-AR和H69細(xì)胞株的表達(dá)；B：mTRAF6在H69-AR和H69細(xì)胞株的表達(dá)；C：H69-AR與NC細(xì)胞72 h侵染圖片×100；D：miR-146a-5p在H69-AR mimic組和NC組中的表達(dá)；E：H69與NC細(xì)胞72 h侵染圖片×100；F：miR-146a-5p在H69 inhibitor組和NC組中的表達(dá)；與H69細(xì)胞株比較：*P<0.05，**P<0.01；與NC組比較：##P<0.01

3 討論

本研究課題前期通過選取2對(duì)化療敏感和化療耐藥血漿標(biāo)本(同一患者耐藥前后),采用超高速離心法提取血漿外泌體,再通過高通量測(cè)序技術(shù)篩選出SCLC 耐藥前后外泌體內(nèi)顯著差異的miRNAs，結(jié)果顯示SCLC耐藥后外泌體中miR-146a-5p表達(dá)水平較耐藥前顯著下調(diào),結(jié)果提示miR-146a-5p可能跟SCLC 耐藥有關(guān)。本研究首先使用qRT-PCR檢測(cè)了H69-AR和H69細(xì)胞中miR-146a-5p的表達(dá)水平,結(jié)果顯示H69-AR相比H69細(xì)胞株中miR-146a-5p的表達(dá)水平下調(diào)，與之前在血漿中高通量測(cè)序結(jié)果一致。然后通過慢病毒載體穩(wěn)轉(zhuǎn)染使其H69-AR細(xì)胞中miR-146a-5p過表達(dá)以及使其H69細(xì)胞中miR-146a-5p低表達(dá)，通過CCK-8、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到轉(zhuǎn)染過表達(dá)后可以抑制腫瘤的增殖速率、遷移、轉(zhuǎn)染，低表達(dá)后結(jié)果正好與之相反，說明miR-146a-5p可以起到類似抑癌基因作用抑制SCLC耐藥或是使其SCLC重新敏化。

圖3 mIRAK1、mTRAF6分別在H69-AR mimic和H69 inhibitor細(xì)胞中的差異表達(dá)

與NC組比較：**P<0.01，*P<0.05

圖4 CCK-8檢測(cè)miR-146a-5p在不同濃度CDDP下對(duì)細(xì)胞抑制的影響

A：H69-AR組在不同濃度CDDP中細(xì)胞抑制率；B：H69-AR mimic組在不同濃度CDDP中的細(xì)胞抑制率； C：H69 inhibitor組在不同濃度CDDP中的細(xì)胞抑制率；與H69組比較：#P<0.05；與NC組比較：**P<0.01，*P<0.05

利用生物信息學(xué)軟件以及查閱相關(guān)大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p的潛在靶基因?yàn)镮RAK1、TRAF6。I-RAK1是白介素1受體相關(guān)激酶家族中重要的一員，它不僅是一種調(diào)控炎癥的信號(hào)分子,同時(shí)也是托爾樣受體信號(hào)通路的信號(hào)分子,當(dāng)缺失激活托爾樣受體信號(hào)通路時(shí)，可能與癌癥、自身免疫性、和敗血癥疾病等相關(guān)[12]。TRAF6是腫瘤壞死因子家族信號(hào)通路里非常重要的一種信號(hào)分子[13], TRAF6參與了肺癌、骨肉瘤、食管癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等多種癌癥的進(jìn)展[14]。本研究結(jié)果顯示，H69-AR細(xì)胞相比H69細(xì)胞中mTRAF6、mIRAK1表達(dá)水平均下調(diào)，又通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染,結(jié)果顯示，TRAF6、IRAK1在H69-AR mimic細(xì)胞中蛋白表達(dá)低于對(duì)照組細(xì)胞中蛋白表達(dá);TRAF6、IRAK1在H69 inhibitor細(xì)胞中蛋白表達(dá)高于對(duì)照組細(xì)胞中蛋白表達(dá)，以上這些結(jié)果說明miR-146a-5p表達(dá)水平與mTRAF6、mIRAK1表達(dá)水平以及他們的蛋白表達(dá)都呈負(fù)相關(guān)，由此可以認(rèn)為miR-146a-5p與IRAKl、TRAF6存在負(fù)調(diào)控關(guān)系，同時(shí)也提示miR-146a-5p、TRAF6、IRAK1可能共同參與了SCLC耐藥。蔣亮 等[15]在前列腺腫瘤細(xì)胞中利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，已證實(shí)miR-146a-5p可以直接結(jié)合在IRAK1和TRAF6基因的3′-UTR區(qū)域，抑制熒光素酶的表達(dá)。關(guān)于在SCLC細(xì)胞中miR-146a-5p與IRAKl、TRAF6的靶點(diǎn)如何結(jié)合，今后還需要應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)。

圖5 H69-AR mimic與NC在24、48 h時(shí)間下觀察細(xì)胞劃痕遷移情況

A：H69-AR組與NC組分別在0、24、48 h遷移情況×100；B：H69-AR組在24、48 h遷移距離；與NC組比較：*P<0.05

圖6 轉(zhuǎn)染H69-AR mimic、H69-AR NC、H69 inhibitor、H69 NC細(xì)胞后，IRAK1和TRAF6的蛋白表達(dá)