朱戈麗，林 莉，伍 軍，畢智敏，鞏雪敏，李菊霜

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是多種慢性腎臟疾病發(fā)展為終末期腎病的主要途徑。百令膠囊是人工培養(yǎng)的一種冬蟲夏草菌絲，具有增強(qiáng)免疫力、抗纖維化、保護(hù)腎功能等作用[1]。還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)是由谷氨酸、胱氨酸及甘氨酸組成的一種三肽，在機(jī)體的脂質(zhì)過氧化損傷中具有重要作用[2]。已有研究[3]表明，百令膠囊和GSH均可以抑制RIF，保護(hù)腎組織結(jié)構(gòu)和功能損傷，但其具體的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。課題組前期研究[4]顯示，百令膠囊聯(lián)合GSH可以抑制單側(cè)輸尿管梗阻大鼠的腎組織纖維化。因此，該研究從細(xì)胞水平上分析了百令膠囊加GSH含藥血清對(duì)大鼠間質(zhì)成纖維細(xì)胞NRK-49F的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性大鼠20只，7～8周齡，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2017-0012，保持室溫恒定為25 ℃，模擬晝夜光照，自由攝食與飲水。

1.2 儀器與試劑酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC)購(gòu)自日本SANYO公司；大鼠腎成纖維細(xì)胞NRK-49F由上海拜力生物科技有限公司提供；百令膠囊購(gòu)自杭州中美華東制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字Z10910036)；GSH購(gòu)自上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H20031265)；CCK8檢測(cè)試劑盒由廣州Biosharp提供；無(wú)支原體胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；兔抗大鼠增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、Ⅰ型膠原(Collagen Ⅰ)抗體、Sma和Mad相關(guān)蛋白2(sma and mad-related protein，Smad2)抗體、磷酸化Smad2(phosphorylation of Smad2，p-Smad2)抗體、Smad3抗體、p-Smad2抗體、α肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑均購(gòu)自日本TaKaRa公司；PCR引物由南京金斯瑞有限公司合成。

1.3 動(dòng)物含藥血清的制備大鼠禁食水12 h后，采用結(jié)扎左側(cè)輸尿管建立單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型[5]。治療組大鼠每日給予百令膠囊1.5 g/kg聯(lián)合GSH 300 mg/kg灌胃治療，治療時(shí)間為術(shù)前1 d至術(shù)后第9天；模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。無(wú)菌采集各組大鼠血液，3 000 r/min離心10 min，56 ℃水浴鍋滅活補(bǔ)體30 min；經(jīng)0.22 μm濾菌膜過濾除菌，置于-80 ℃冰箱備用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型組、陰性對(duì)照組和藥物干預(yù)組。正常對(duì)照組采用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)大鼠腎成纖維細(xì)胞NRK-49F；模型組用含有10 ng/ml TGF-β1的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)NRK-49F細(xì)胞，誘導(dǎo)纖維化；陰性對(duì)照組用含有10%模型組大鼠血清和10 ng/ml TGF-β1的培養(yǎng)基培養(yǎng)NRK-49F細(xì)胞；藥物干預(yù)組用含有10%治療組大鼠的含藥血清和10 ng/ml TGF-β1的培養(yǎng)基培養(yǎng)NRK-49F細(xì)胞。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)。

1.5 CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖取各組NRK-49F細(xì)胞，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h。待細(xì)胞培養(yǎng)至設(shè)定時(shí)間后，每孔加入10 μl CCK8，37 ℃培養(yǎng)4 h；酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔吸光值 (optical density，OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率=(OD實(shí)驗(yàn)孔-OD空白孔)/(OD對(duì)照孔-OD空白孔)，每組重復(fù)6次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布將各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，制成單細(xì)胞懸液，加入1 ml 75%乙醇、-20 ℃固定24 h，加入0.4 μl PI(30 mg/ml)混合，避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，ModFit LT分析并擬合計(jì)算各時(shí)期細(xì)胞百分比。Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1的表達(dá)，每組重復(fù)6次。

1.7 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)確定RNA濃度，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以GAPDH作為內(nèi)參，反應(yīng)引物、體系和條件參考已有文獻(xiàn)[6]，每組重復(fù)6次。

1.8 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解液提取總蛋白， BCA法進(jìn)行蛋白定量，取50 ng蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫密封2 h，采用TBST洗膜并加一抗Collagen Ⅰ、α-SMA、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3(稀釋比例均為1 ∶ 1 000)，于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜加HRP標(biāo)記的二抗IgG(稀釋比例均為1 ∶ 5 000)，于室溫下孵育2 h。再用ECL化學(xué)發(fā)光顯示，收集影像，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析對(duì)比條帶強(qiáng)弱，選用β-actin作為內(nèi)參，每組重復(fù)6次。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠NRK-49F細(xì)胞的形態(tài)正常對(duì)照組NRK-49F細(xì)胞排列緊密，呈長(zhǎng)梭形；模型組和陰性對(duì)照組NRK-49F細(xì)胞體積增大，呈短梭或多角形，胞核增大呈圓形或橢圓形；藥物干預(yù)組NRK-49F細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)接近正常對(duì)照組。見圖1。

2.2 百令膠囊聯(lián)合GSH對(duì)大鼠NRK-49F細(xì)胞增殖的影響CCK8實(shí)驗(yàn)顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組和陰性對(duì)照組NRK-49F細(xì)胞的增殖活性增加(P<0.05)；與陰性對(duì)照組比較，藥物干預(yù)組NRK-49F細(xì)胞的增殖活性下降(P<0.05)。Western blot 顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組和陰性對(duì)照組NRK-49F細(xì)胞PCNA的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與陰性對(duì)照組比較，藥物干預(yù)組NRK-49F細(xì)胞PCNA的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見圖2、表1。

圖1 各組大鼠NRK-49F細(xì)胞的形態(tài) ×100

A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：陰性對(duì)照組；D：藥物干預(yù)組

圖2 Western blot法檢測(cè)各組NRK-49F細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)

表1 百令膠囊聯(lián)合GSH對(duì)大鼠NRK-49F細(xì)胞增殖的影響

與正常對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

2.3 百令膠囊聯(lián)合GSH對(duì)大鼠NRK-49F細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組和陰性對(duì)照組NRK-49F細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞減少(P<0.05)，S期細(xì)胞增加(P<0.05)；與陰性對(duì)照組比較，藥物干預(yù)組NRK-49F細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞增加(P<0.05)，S期細(xì)胞減少(P<0.05)。Western blot 檢測(cè)顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組和陰性對(duì)照組NRK-49F細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與陰性對(duì)照組比較，藥物干預(yù)組NRK-49F細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 Western blot法檢測(cè)各組NRK-49F細(xì)胞Cyclin D1蛋白的表達(dá)

2.4 百令膠囊聯(lián)合GSH對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通

表2 百令膠囊聯(lián)合GSH對(duì)大鼠NRK-49F細(xì)胞周期的影響

與正常對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

路表達(dá)的影響Western blot 檢測(cè)顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組和陰性對(duì)照組NRK-49F細(xì)胞Collagen Ⅰ、α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與陰性對(duì)照組比較，藥物干預(yù)組NRK-49F細(xì)胞Collagen Ⅰ、α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.5 百令膠囊聯(lián)合GSH對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響RT-PCR檢測(cè)顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組和陰性對(duì)照組NRK-49F細(xì)胞Collagen Ⅰ、α-SMA、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與陰性對(duì)照組比較，藥物干預(yù)組NRK-49F細(xì)胞Collagen Ⅰ、α-SMA、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見表4。

表3 百令膠囊聯(lián)合GSH對(duì)NRK-49F細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響

與正常對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

表4 百令膠囊聯(lián)合GSH對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄水平的影響

與正常對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

3 討論

成纖維細(xì)胞在缺血、缺氧、炎癥等刺激下的過度活化、增殖是導(dǎo)致RIF的主要因素之一[7]。TGF-β1是RIF過程中的關(guān)鍵促纖維化因子，可以刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，并抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)RIF[8]。本研究顯示，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-49F細(xì)胞呈短梭形或多角形，出現(xiàn)了細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變?；诒菊n題組前期研究[4]，百令膠囊聯(lián)合GSH可以有效抑制RIF的產(chǎn)生，保護(hù)腎臟組織。因此，本研究將體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，采用大鼠百令膠囊加GSH含藥血清與NRK-49F細(xì)胞進(jìn)行孵育，從細(xì)胞水平上分析其作用機(jī)制。本研究中，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-49F細(xì)胞存活率增加，百令膠囊聯(lián)合GSH含藥血清作用后可以抑制NRK-49F細(xì)胞過高的增殖活性，G1期細(xì)胞數(shù)量減少，S期細(xì)胞數(shù)量增加，且細(xì)胞增殖蛋白PCNA和細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)下降。PCNA是一種與細(xì)胞DNA合成相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原，在細(xì)胞增殖的過程中具有重要作用。Cyclin D1為G1期細(xì)胞周期素，能夠促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S檢查點(diǎn)。姚素花 等[9]的研究顯示，百令膠囊可以降低腹液透析患者的TGF-β1水平，抑制RIF。秦靜 等[10]的研究顯示，GSH可以抑制TGF-β1的表達(dá)，抑制肝組織的纖維化，本研究結(jié)果與之基本一致，提示百令膠囊聯(lián)合GSH可能通過抑制TGF-β1的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-49F細(xì)胞增殖。

有研究[11-12]顯示，TGF-β/Smad信號(hào)通路在RIF的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。Smad蛋白是將TGF-β1從受體到細(xì)胞核內(nèi)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，包括Smad2、Smad3、Smad4等，通過與其他DNA結(jié)合蛋白作用調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)TGF-β在胞膜與其受體結(jié)合后，可磷酸化Smad2和Smad3，使其活化，而活化的Smad2、Smad3與Smad4結(jié)合共同形成一個(gè)三聚體，共同轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)一步來(lái)調(diào)節(jié)下游效應(yīng)分子α-SMA、基質(zhì)金屬蛋白酶等，誘導(dǎo)RIF產(chǎn)生。本研究中，TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-49F細(xì)胞Smad2和Smad3的磷酸化水平升高，α-SMA和Collagen I的表達(dá)上調(diào)，百令膠囊聯(lián)合GSH含藥血清作用后可以抑制Smad2和Smad3的磷酸化，下調(diào)α-SMA和Collagen I的表達(dá)，提示百令膠囊聯(lián)合GSH含藥血清可能通過抑制TGF-β1的表達(dá)，抑制Smad2和Smad3的磷酸化，抑制RIF。α-SMA是成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和沉積，促進(jìn)RIF的發(fā)生。Collagen I是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在RIF的病理過程中發(fā)揮了重要作用。熊有明 等[13]的研究顯示，百令膠囊可以抑制TGF-β1和Collagen Ⅳ的表達(dá)，延緩腎臟的纖維化過程。馬志敏 等[14]的研究顯示，GSH可以抑制TGF-β1、Smad的表達(dá)，抑制大鼠的肺纖維化，本研究結(jié)果與之基本一致，提示百令膠囊聯(lián)合GSH含藥血清可能通過抑制TGF-β1/Smad的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，抑制RIF的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，百令膠囊聯(lián)合GSH含藥血清可能通過抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-49F細(xì)胞的過度增殖，為臨床RIF的治療提供選擇依據(jù)，同時(shí)也為新藥物靶點(diǎn)的研發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。