周 芳,張耀超,郭 娜,李子夏,梁 斌(西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔正畸學(xué)教研室,西安 700;西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔解剖生理學(xué)教研室;西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)教研室;西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科學(xué)教研室;西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔組織病理學(xué)教研室;通訊作者,E-mail:90686@qq.com)

流行病學(xué)調(diào)查顯示牙周病是我國(guó)成年人牙齒喪失的首要原因[1],牙周病患者因?yàn)檠例X松動(dòng)、移位、脫落,不僅影響日常生活,還會(huì)造成牙槽骨廢用性骨損傷,進(jìn)而加速骨量丟失[2],進(jìn)入惡性循環(huán)。正畸治療是目前牙周病綜合治療的重要方法之一,通過(guò)復(fù)位松動(dòng)移位的牙齒,改變牙齒受力方向,消除咬合創(chuàng)傷,有利于牙周組織的恢復(fù)[3]。但是目前,牙周病患者的正畸治療還存在很大風(fēng)險(xiǎn),有部分患者出現(xiàn)了牙周炎癥再度進(jìn)展的情況[4,5]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是近期組織工程研究的熱點(diǎn),具有多向分化潛能,在體內(nèi)外均有較強(qiáng)的可塑性,可以通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)組織器官,抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá),阻止炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[6,7],但BMSCs的局部應(yīng)用是否能夠達(dá)到同樣的效果仍不明確。本研究制備靜止期牙周病動(dòng)物模型,局部植入BMSCs膜片并模擬正畸臨床治療對(duì)動(dòng)物模型牙齒加力,觀察BMSCs膜片的局部應(yīng)用對(duì)靜止期牙周病動(dòng)物模型牙齒移動(dòng)后IL-6表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周SD雄性大鼠4只,體質(zhì)量(200±20)g,28周SD雄性大鼠81只,體質(zhì)量(330±25.4)g,購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):No.201722172。

1.2 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基,購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS),購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;胰蛋白酶,購(gòu)自Hyclone公司;雙抗(鏈霉素、青霉素)、EDTA抗原修復(fù)液,檸檬酸抗原修復(fù)液,DAPI染液均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、茜素紅、油紅O、多聚甲醛、無(wú)水乙醇均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Pipetman L微量可調(diào)加樣器,Gilson公司產(chǎn)品;Allegra 64R Centrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),Beckman Coulter公司產(chǎn)品;Thermo 311 CO2培養(yǎng)箱,Thermo scientific公司產(chǎn)品;BCM-1300A超凈工作臺(tái),蘇凈安泰公司產(chǎn)品,Echo Revolve正置倒置一體熒光顯微鏡,Echo公司產(chǎn)品。

1.3 靜止期牙周病動(dòng)物模型建立

28周SD雄性大鼠81只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組(25只)和實(shí)驗(yàn)組(56只)。實(shí)驗(yàn)組大鼠麻醉,仰臥固定,絲線結(jié)扎上頜右側(cè)第一磨牙牙頸部,壓入齦下,隔天檢查。6周后檢查實(shí)驗(yàn)組大鼠上頜右側(cè)第一磨牙牙周探診深度和出血情況,隨機(jī)處死3只大鼠制作牙周組織切片以評(píng)定牙周病動(dòng)物模型建立成功。再次麻醉實(shí)驗(yàn)組大鼠,去除結(jié)扎絲,上頜右側(cè)第一磨牙行牙周基礎(chǔ)治療。術(shù)后4周檢查實(shí)驗(yàn)組大鼠上頜右側(cè)第一磨牙牙周探診深度和出血情況,隨機(jī)處死3只大鼠制作牙周組織切片以評(píng)定靜止期牙周病動(dòng)物模型建立成功[8]。與此同時(shí),對(duì)照組不作任何處理,置于實(shí)驗(yàn)組同樣飼養(yǎng)環(huán)境下自由進(jìn)食，飲水。

1.4 BMSCs培養(yǎng)

6周SD雄性大鼠脫頸處死,無(wú)菌取出大鼠股骨,沖出骨髓,全骨髓細(xì)胞貼壁法并頻繁換液培養(yǎng)BMSCs[9-11]。

1.5 細(xì)胞膜片制作

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs,制備細(xì)胞膜片[12],膜片部分行Von Kossa染色,顯微鏡下可見(jiàn)褐色礦化結(jié)節(jié)。

1.6 細(xì)胞膜片植入

實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為膜片+加力組和單純加力組,每組25只。膜片+加力組動(dòng)物模型使用甲苯噻嗪(5 mg/kg)和氯胺酮(100 mg/kg)麻醉,行牙周翻瓣手術(shù),暴露上頜右側(cè)第一磨牙根分叉處,BMSCs膜片折疊成小團(tuán)塊,植入,縫合黏膜,術(shù)后下肢肌肉注射抗生素3 d。

1.7 動(dòng)物模型牙齒加力

細(xì)胞膜片植入7 d后,膜片+加力組和單純加力組動(dòng)物模型麻醉,直徑0.2 mm的不銹鋼結(jié)扎絲環(huán)繞上頜右側(cè)切牙及第一磨牙牙頸部,結(jié)扎絲置牙齦上粘結(jié)固定。兩牙之間通過(guò)彈力橡皮鏈加力,力值50 g(見(jiàn)圖1)。隔天檢查,如加力裝置脫落或固位不佳,重新安裝。

1.8 取材和染色

各組分別于加力0,7,14,21,28 d各處死5只大鼠,取右側(cè)上頜骨,沖洗、固定、脫鈣、包埋,沿第一磨牙矢狀面切片,厚度4 μm,HE染色觀察牙周組織學(xué)變化,免疫熒光染色觀察IL-6表達(dá)的變化。IL-6陽(yáng)性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記下呈紅色。每張切片隨機(jī)挑選3個(gè)400倍視野拍照,應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件將紅色熒光單色照片轉(zhuǎn)換為黑白圖片后選取相同的黑色作為判斷所有照片陽(yáng)性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出累積光密度值(increase optical density,IOD)及組織像素面積(area),計(jì)算平均光密度值(average optical density, AO),AO=IOD/area,AO越大表示陽(yáng)性表達(dá)水平越高。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad prism8.0.2軟件處理數(shù)據(jù)并制圖,多樣本間的比較采用單因素方差分析,各組方差齊性時(shí),采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較,若方差不齊,采用Tamhane’T2法,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示,加力0 d,膜片+加力組和單純加力組動(dòng)物模型右側(cè)上頜第一磨牙牙周膜纖維排列整齊,單純加力組牙槽骨表面可見(jiàn)小面積骨吸收陷窩。加力7 d,膜片+加力組和單純加力組牙周膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn),血管擴(kuò)張,纖維排列紊亂,相鄰牙槽骨可見(jiàn)骨吸收陷窩。加力14 d,膜片+加力組牙周膜血管擴(kuò)張減少,炎性細(xì)胞減少,相鄰牙槽骨均勻吸收;但單純加力組牙周膜血管擴(kuò)張仍舊明顯,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),纖維排列紊亂,相鄰牙槽骨可見(jiàn)大面積不規(guī)則骨吸收陷窩。加力21 d,膜片+加力組牙周膜膠原纖維開(kāi)始恢復(fù),相鄰牙槽骨小面積骨吸收陷窩;但單純加力組仍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),纖維排列紊亂,相鄰牙槽骨吸收明顯。加力28 d,膜片+加力組牙周膜膠原纖維恢復(fù),相鄰牙槽骨基本完整;單純加力組仍有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),相鄰牙槽骨表面可見(jiàn)骨吸收陷窩(見(jiàn)圖2)。

R:牙根;P:牙周膜;B:牙槽骨;綠色箭頭示炎性細(xì)胞;黑色箭頭示牙槽骨吸收

2.2 IL-6的表達(dá)

加力0,7,14,21,28 d,單純加力組IL-6表達(dá)平均光密度值(AO)均較對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;加力7,14,21,28 d,膜片+加力組AO較對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表1)。

相同加力時(shí)間下,單純加力組AO均較膜片+加力組升高,在加力0,14,21 d,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表1、圖3、圖4)。

表1 各組動(dòng)物模型IL-6表達(dá)平均光密度值(AO)的差異Table 1 The average optical density(AO) of IL-6 expression in animal models with different

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與單純加力組相比,#P<0.05

加力7 d,膜片+加力組與單純加力組動(dòng)物模型右側(cè)上頜第一磨牙牙周組織AO均達(dá)到頂峰,7 d后開(kāi)始下降,膜片+加力組在加力7-21 d下降較快,單純加力組在加力21-28 d下降較快(見(jiàn)圖5)。

圖3 加力14 d時(shí)膜片+加力組與單純加力組IL-6表達(dá)的差異Figure 3 Difference of IL-6 expression between orthodontic group and sheet combined with orthodontic group at 14 d after the forcement

圖4 加力21 d時(shí)膜片+加力組與單純加力組IL-6表達(dá)的差異Figure 4 Difference of IL-6 expression between orthodontic group and sheet combined with orthodontic group at 21 d after the forcement

圖5 不同加力時(shí)間下膜片+加力組與單純加力組AO的變化Figure 5 Changes of IL-6 expression in orthodontic group and sheet combined with orthodontic group at different time after orthodontic force

3 討論

牙周病患者因?yàn)檠乐苤С纸M織的破壞,常導(dǎo)致前牙唇向移位,不僅影響咀嚼功能,還嚴(yán)重影響美觀,相比常規(guī)的牙周基礎(chǔ)治療,牙周-正畸聯(lián)合治療可以控制牙周炎癥,排齊牙列,改善咀嚼功能,解除咬合創(chuàng)傷,有利于牙周組織的恢復(fù)。但是目前不是所有牙周病患者接受正畸治療都可以獲得很好的治療效果。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分患者在正畸治療中出現(xiàn)了牙齒松動(dòng)、牙槽骨形態(tài)異常的情況[13],這可能是患者處于靜止?fàn)顟B(tài)的牙周炎癥被激活,導(dǎo)致牙齒松動(dòng)程度增高,附著喪失加重,出現(xiàn)了牙周病活動(dòng)期的癥狀。

目前的研究認(rèn)為牙齒移動(dòng)實(shí)質(zhì)是牙周組織的炎性反應(yīng),當(dāng)適宜的力在一定時(shí)間內(nèi)作用于牙齒上,牙周膜在應(yīng)力作用下,刺激相應(yīng)區(qū)域內(nèi)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞發(fā)揮作用,在特定的時(shí)間和部位分泌并表達(dá)多種生長(zhǎng)因子,調(diào)控牙槽骨的沉積和吸收,從而使牙齒移動(dòng)到新的位置。與牙周炎癥和正畸牙齒移動(dòng)骨改建相關(guān)的細(xì)胞因子較多,其中IL-6是骨吸收的標(biāo)志物之一,在牙周病的發(fā)生發(fā)展及正畸牙齒移動(dòng)中起著重要作用[14,15],且IL-6的表達(dá)與牙周炎癥嚴(yán)重程度存在正相關(guān)[16],可以用IL-6的表達(dá)量作為牙周破壞程度的指標(biāo)。本研究中,各組動(dòng)物模型AO差異顯著,在相同加力時(shí)間下,單純加力組與膜片+加力組動(dòng)物模型AO均較對(duì)照組升高,在加力7 d時(shí),單純加力組與膜片+加力組AO均達(dá)到頂峰,之后逐漸降低,說(shuō)明靜止期牙周病動(dòng)物模型在牙齒移動(dòng)過(guò)程中,尤其是牙齒移動(dòng)初期的確出現(xiàn)了牙周組織炎癥加重的情況。

BMSCs是組織工程學(xué)研究的種子細(xì)胞之一,可以體外誘導(dǎo)分化為不同的組織細(xì)胞,全身運(yùn)用可修復(fù)組織器官的病理?yè)p傷,血液輸注有助于調(diào)節(jié)膿毒癥大鼠免疫,降低炎癥因子水平[17,18]。細(xì)胞膜片技術(shù)可以促使種子細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)大量分泌細(xì)胞外基質(zhì),使細(xì)胞緊密連結(jié)形成片狀結(jié)構(gòu),減少細(xì)胞移植過(guò)程中產(chǎn)生的無(wú)效細(xì)胞數(shù)量[19]。本研究培養(yǎng)BMSCs并制備細(xì)胞膜片,局部植入靜止期牙周病動(dòng)物模型,再模擬正畸治療對(duì)動(dòng)物模型牙齒加力,研究發(fā)現(xiàn),在相同加力時(shí)間下,膜片+加力組AO均較單純加力組降低,且兩組AO達(dá)到峰值后,膜片+加力組AO下降也較單純加力組快。HE染色結(jié)果也顯示,兩組在組織學(xué)表現(xiàn)上存在差異,膜片+加力組動(dòng)物模型在炎癥控制、膠原纖維恢復(fù)等方面較單純加力組出現(xiàn)得早,也不似單純加力組出現(xiàn)大面積不規(guī)則牙槽骨吸收的現(xiàn)象。由此提示,BMSCS膜片可以通過(guò)抑制IL-6生成,減輕牙周組織的炎癥反應(yīng),降低牙槽骨的破壞程度。

綜上所述,BMSCs膜片的局部應(yīng)用可以抑制IL-6生成,減輕靜止期牙周病動(dòng)物模型牙齒移動(dòng)后牙周組織的炎癥反應(yīng),從而降低牙槽骨的破壞程度。但膜片植入的最佳時(shí)機(jī)和部位還需要進(jìn)一步研究,并進(jìn)行臨床驗(yàn)證。