楊 楊,崔憶旋,胡 婷,趙夢琳,汪子書(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內科,蚌埠 233000;通訊作者,E-mail:wzshahbb@163.com)

胃癌不僅是全球第四大常見癌癥,也是導致癌癥相關死亡的第二大原因[1]。目前胃癌的治療包括手術、化療、放療和分子靶向治療,其中手術聯(lián)合放化療是最有效的治療方案[2]。然而,由于先天性或獲得性耐藥及術后復發(fā),胃癌治療已進入瓶頸期[3]。因此,有必要尋找與胃癌進展相關的新靶點和信號通路來治療胃癌。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞不受控制的增殖密切相關,而許多惡性腫瘤細胞通過凋亡逃逸獲得無限的增殖能力[4]。在20世紀70年代,Kerr等[5]提出了凋亡與消除潛在的惡性細胞、增殖和腫瘤進展相關的理論。目前凋亡的三種逃避機制被廣泛接受,包括死亡受體通路的損傷、Caspase功能的減弱、促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白平衡的破壞[6]。因此,通過調控凋亡信號通路中關鍵蛋白或酶的表達或功能來靶向癌細胞凋亡成為癌癥研究的熱點[7]。此外,有報道稱一些天然產物可調節(jié)細胞凋亡信號通路,最終導致癌細胞死亡?？鄥A是從苦參中提取的生物堿,通過促進促凋亡蛋白的表達,改變Fas/FasL,激活Caspase-3,促進胃癌細胞凋亡[8,9]。因此,從天然植物產物中尋找潛在的抗癌藥物成為一項研究熱點。

去甲澤拉木醛是從雷公藤中提取的三萜單體,廣泛應用于抗炎免疫調節(jié)、抗生育、雌激素代謝調節(jié)等研究[10-13],近年去甲澤拉木醛的抗癌特性也在逐漸被開發(fā)。研究表明,去甲澤拉木醛在三陰性乳腺癌、膠質瘤及黑色素瘤中都發(fā)揮著明顯的抗腫瘤作用[14-16]。但是,去甲澤拉木醛對胃癌的抗癌活性及其作用機制尚不清楚。本實驗主要探討去甲澤拉木醛對胃癌細胞(AGS)的影響及其可能機制,為胃癌的臨床治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人胃癌細胞AGS(人胃癌腺細胞系)購自美國American type culture collection公司,培養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學院癌癥醫(yī)學轉化中心實驗室。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(含EDTA)和雙抗(青霉素/鏈霉素)購自美國Gibco公司,胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司,CCK-8試劑盒、BCA試劑盒、磷酸緩沖鹽水溶液(PBS)購于上海碧云天公司,雙染細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin Ⅴ-FITC/PI)購自杭州聯(lián)科生物公司,結晶紫購自上海生工生物工程公司,瑞氏-吉姆薩染色液購于南京建成科技公司,ERK1/2、p-ERK1/2、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3蛋白抗體購自美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人胃癌細胞AGS培養(yǎng)在含10% FBS、1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,在37 ℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 CCK-8實驗檢測細胞毒性

取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的人胃癌細胞AGS,胰酶消化得單細胞懸液,離心,棄上清,再次加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基后計數(shù),在96孔板中接種細胞懸液(100 μl/孔),每孔約含5 000個細胞,培養(yǎng)過夜,待細胞融合達80%左右加入不同濃度的去甲澤拉木醛(0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,30,50 μmol/L)。將細胞放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h每孔加入10 μl的CCK-8溶液。繼續(xù)培養(yǎng)2 h,利用酶標儀于分光度為450 nm處測OD值,計算細胞在不同濃度去甲澤拉木醛下的活力:細胞活力(%)=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%,計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 克隆形成實驗檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的人胃癌細胞AGS,以每孔大約500個細胞接種于6孔板,依次加入0,0.05,0.1,0.5,1,10 μmol/L去甲澤拉木醛溶液。將6孔板放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)7 d,直到空白組形成多于200個細胞克隆時,終止培養(yǎng)。丟棄培養(yǎng)基,用預先冷卻的PBS溶液清洗兩遍后,每孔加滴加800 μl甲醇固定30 min,棄甲醇。向每個孔中滴加800 μl瑞氏-吉姆薩染色液試劑一,以覆蓋孔的底部,染色20 min。保留試劑一,滴加1 600 μl試劑二,輕輕搖晃,使兩種染液充分混勻,染色20-25 min,倒去兩種混合后的染色溶液,用自來水洗滌3次,自然風干并拍照。使用軟件Image J,進行統(tǒng)計圖像的灰度統(tǒng)計并計算抑制率,計算公式為:克隆形成抑制率=給藥組的灰度值/溶劑對照組的灰度值×100%。

1.5 Transwell實驗檢測細胞遷移

取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的人胃癌細胞AGS,將含2×105個細胞的無血清細胞懸液加入至上層小室,并在上層小室中分別加入不同濃度的去甲澤拉木醛(0,1,3,10 μmol/L),在下層小室內加入600 μl的RPMI-1640完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h,丟棄上腔液,去除膜表面殘留細胞。將小室用甲醇固定20 min,0.5%結晶紫染色20 min,最后,染色細胞用光學顯微鏡200倍放大觀察和拍照。使用軟件Image J計算細胞遷移的面積。

1.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡

選取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的AGS細胞,以每孔3×105的細胞密度接種于12孔板,待次日貼壁后加入濃度分別為0,1,3,10 μmol/L的去甲澤拉木醛,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,收集上清于對應的流式管中,用不含EDTA的胰酶消化細胞,終止消化,將細胞收集到流式管中。500g離心5 min,棄上清,再用預冷的PBS清洗兩遍,此步最后一次PBS均分出雙陰、Annexin Ⅴ-FITC組和單PI組。每管加入400 μl Annexin Ⅴ-FITC結合液(1×binding buffer)混勻;加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI染色液輕輕混勻于室溫避光15 min孵育染色;在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.7 Western blot法檢測ERK1/2、p-ERK1/2、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3蛋白表達水平

用不同濃度的去甲澤拉木醛(0,1,3,10 μmol/L)處理細胞24 h,0.25%胰酶消化,離心分離收集細胞,PBS漂洗2次,在冰上加入PIPA細胞裂解液進行裂解,收集細胞的總蛋白,BCA法測定蛋白水平。將蛋白總量相同的樣本加入到12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)內進行蛋白分離,轉移至PVDF膜。5%脫脂牛奶在室溫封閉2 h,TPBS洗滌7 min,重復3次。按1∶1 000的比例分別稀釋β-actin、ERK1/2、p-ERK1/2、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3一抗,膜與不同的一抗4 ℃孵育過夜,次日用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG(二抗)室溫下孵育2 h,ECL發(fā)光試劑盒顯影。

1.8 統(tǒng)計學分析

利用GraphPad Prism 7軟件進行分析實驗數(shù)據(jù),實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,各組間差異采用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組間差異。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 去甲澤拉木醛對AGS細胞具有細胞毒性作用

CCK-8結果顯示,AGS細胞經不同濃度去甲澤拉木醛(0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,30,50 μmol/L)處理24 h,細胞的存活率隨著去甲澤拉木醛濃度的升高而下降,表明去甲澤拉木醛對AGS細胞具有細胞毒性作用,作用24 h的IC50值為18.45 μmol/L。與0 μmol/L相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1)。

與0 μmol/L相比,*P<0.05

2.2 去甲澤拉木醛對AGS細胞具有增殖抑制作用

AGS細胞經不同濃度去甲澤拉木醛處理7 d后,隨著去甲澤拉木醛濃度的增加,克隆形成數(shù)量明顯降低。與0 μmol/L相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖2)。

2.3 去甲澤拉木醛抑制AGS細胞遷移

用不同濃度去甲澤拉木醛處理AGS細胞24 h,觀察其對細胞遷移能力的影響。Transwell實驗結果顯示,與對照組相比,去甲澤拉木醛明顯抑制了胃癌細胞的遷移。此外,去甲澤拉木醛可抑制AGS細胞遷移,呈劑量依賴性(P<0.001,見圖3)。

圖2 去甲澤拉木醛對AGS細胞的增殖抑制作用Figure 2 The anti-proliferation activity of demethylzeylasteral in AGS cells

圖3 去甲澤拉木醛對AGS細胞遷移的抑制作用Figure 3 Demethylzeylasteral suppressed the migration of AGS cells

2.4 去甲澤拉木醛誘導AGS細胞凋亡

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染實驗,流式分析結果顯示不同濃度的去甲澤拉木醛(0,1,3,10 μmol/L)作用于人胃癌AGS細胞24 h,細胞發(fā)生凋亡,并且隨著藥物濃度的增加,細胞凋亡率明顯增高。與0 μmol/L相比,不同濃度作用后細胞凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.001,見圖4);不同濃度組之間細胞凋亡率相比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見圖4)。

2.5 去甲澤拉木醛對AGS細胞凋亡相關蛋白及ERK1/2蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,與0 μmol/L相比,不同濃度的去甲澤拉木醛(1,3,10 μmol/L)作用于人胃癌AGS細胞24 h,細胞的cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、p-ERK1/2蛋白表達量明顯下調(P<0.05或P<0.001),而ERK1/2蛋白表達量無明顯變化(見圖5)。

圖4 不同濃度去甲澤拉木醛處理24 h對AGS細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of demethylzeylasteral on the apoptosis of AGS cells after treatment for 24 h

與0 μmol/L相比,**P<0.01,***P<0.001;與1 μmol/L相比,#P<0.05,##P<0.01;與3 μmol/L相比,&P<0.05,&&P<0.01

3 討論

胃癌是全球主要的健康威脅,是僅次于肺癌的第二大癌癥相關死亡原因。雖然早診率有所提高,但由于術后復發(fā)、獲得性耐藥、晚期轉移等原因[3],胃癌的治療效果仍不理想。尋找新的藥物來治療胃癌成為科研工作者研究的熱點。去甲澤拉木醛是從雷公藤中提取的一種新型三萜類單體,具有廣泛的藥理作用。雖然已知它與乳腺癌[14]、膠質瘤[15]和惡性黑色素瘤[16]有關,但還需要進一步的研究來確定它是否具有廣譜的抗腫瘤作用。

本研究的主要目的是探討去甲澤拉木醛對胃癌細胞的抗癌作用。為此在體外進行了一系列實驗探討去甲澤拉木醛對胃癌細胞的作用及相關機制。由CCK-8細胞毒性實驗及克隆形成實驗的結果可知,去甲澤拉木醛對胃癌AGS細胞具有明顯的細胞毒性和增殖抑制作用,且呈濃度依賴性。除此之外,去甲澤拉木醛還可以抑制胃癌AGS細胞的遷移并誘導細胞凋亡。

細胞凋亡是一種程序性死亡,由線粒體介導的內源性途徑和死亡受體介導的外源性途徑共同驅動[17]。而且這一復雜的機制涉及許多信號通路。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspases)是細胞凋亡機制的核心,因為它們既是細胞死亡的啟動者,又是細胞死亡的執(zhí)行者[18]。一旦被激活,作為啟動者的Caspases就會分裂執(zhí)行身份的Caspases,對特定的細胞底物進行切割,最終導致細胞凋亡[19]。Caspase-9在一個內部的線粒體依賴通路中被激活,進而導致Caspase-3的激活[20],活化后的Caspase-3可以觸發(fā)下游物質PARP的裂解[21],導致染色質裂解,最終導致細胞凋亡[22]。本研究的結果與上述報道一致,表明去甲澤拉木醛可能是通過Caspase級聯(lián)反應的激活來誘導胃癌AGS細胞凋亡。然而越來越多抗腫瘤的研究不僅針對細胞凋亡展開,細胞增殖、遷移等也是抗腫瘤不可或缺的靶點,包含JNK、ERK和P38在內的MAPK蛋白激酶信號通路在細胞增殖、生存和凋亡中發(fā)揮重要作用[23]。目前,ERK 1/2是細胞增殖的關鍵調控因子,磷酸化后的ERK1/2轉移到細胞核,激活多種轉錄因子包括c-Myc、NF-κB和CREB,進而調節(jié)細胞凋亡、增殖和生存等一系列生物過程[24,25]。因此,ERK通路的抑制劑已在臨床試驗中被用作潛在的抗癌藥物[26]。而本實驗Western blot結果表明去甲澤拉木醛能夠下調p-ERK1/2蛋白的表達,從而進一步影響胃癌AGS細胞的凋亡和增殖。

綜上所述,本研究結果顯示,去甲澤拉木醛具有抑制胃癌AGS細胞增殖、遷移和誘導凋亡的作用,其機制可能與Caspase級聯(lián)反應的激活和ERK1/2通路的下調有關。本研究為去甲澤拉木醛的開發(fā)及胃癌的治療提供了參考價值,但詳細機制還有待于進一步的實驗證明。