葉 蕓,李蘇亮,袁小華,劉 冰,相 蓮,閆紅林(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院輸血科,西安 70077;西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科;通訊作者,E-mail:yanhonglin666@63.com)

最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2016年美國前列腺癌新發(fā)病161 360例,占男性腫瘤新發(fā)病例19%;死亡人數(shù)26 730例,占男性腫瘤死亡病例8%[1]。隨著我國人口老齡化的發(fā)展以及飲食結(jié)構(gòu)的改變,前列腺癌的發(fā)病率逐年升高[2]。前列腺癌在全世界范圍內(nèi)已成為備受關(guān)注的公共健康問題。microRNA(miRNA)是一類由21-24個核苷酸組成的高度保守的非編碼單鏈RNA,通過與靶基因不完全或完全互補(bǔ)結(jié)合從而調(diào)控靶基因的表達(dá),在機(jī)體基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的作用[3,4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA作為癌基因或抑癌基因在惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[5]。大量研究證實(shí)miRNA在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展中表達(dá)失調(diào),且前列腺癌患者與正常人群之間存在差異表達(dá)[6,7]。miR-100-5p是miRNA家族重要成員之一,位于染色體11q24.1上,呈高度保守性。miR-100-5p在包括前列腺癌在內(nèi)許多惡性腫瘤中表達(dá)異常[8],參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為,但作用機(jī)制尚不明確。本研究擬觀察miR-100-5p在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)變化以及其對細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響,并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

miR-100-5p mimics、陰性對照NC-mimics(購自廣州銳博生物公司),Trizol試劑、LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司,RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自大連寶生生物公司,Transwell小室購自美國Corning公司,iBlot半干電轉(zhuǎn)印試劑盒購自Invitrogen公司,兔抗人單克隆抗體mTOR及GAPDH購自Abcam公司。

1.2 細(xì)胞系

人前列腺癌細(xì)胞LNCaP和人前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1購自ATCC(Manassas, VA, USA)。RWPE-1細(xì)胞使用含有L-谷氨酰胺的F12K細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco BRL Co. Ltd., USA);LNCaP細(xì)胞使用 Roswell Park Memorial Institute-1640培養(yǎng)基(HyClone, Logan, UT, USA)。所有培養(yǎng)基均補(bǔ)充青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml(HyClone, Logan, UT, USA)和10% exosomes-free FBS(Gibco BRL Co. Ltd., USA)。均置于37 ℃,5% CO2的飽和濕度恒溫箱中常規(guī)培養(yǎng),細(xì)胞用0.05% EDTA消化傳代,取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測miR-100-5p及mTOR的表達(dá)

按照TRIzol試劑說明書提取前列腺癌細(xì)胞LNCaP的總RNA,鑒定純度和含量后,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA合成參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。以cDNA為模板,按照qRT-PCR試劑盒說明書配置反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng),miR-100-5p基因PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min;40個循環(huán)(94 ℃ 20 s,55 ℃ 30 s);mTOR基因PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min;40個循環(huán)(94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)。miR-100-5p以U6作為內(nèi)參基因,mTOR以GAPDH作為內(nèi)參基因,相對表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期LNCaP細(xì)胞分為NC-mimics組和miR-100-5p mimics組,接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,常規(guī)調(diào)節(jié)下培養(yǎng),細(xì)胞融合度達(dá)60%-70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作。嚴(yán)格按LipofectamineTM2000說明書操作分別將NC-mimics和miR-100-5p mimics轉(zhuǎn)染至LNCaP細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24 h,qRT-PCR檢測miR-100-5p的表達(dá),確定轉(zhuǎn)染效率后再進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞的增殖活性

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按5 000/孔的密度分別種于96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，每24 h加入10 μl CCK-8反應(yīng)液37 ℃繼續(xù)孵育，在Multiskan FC酶標(biāo)儀上測定450 nm波長處各孔不同時(shí)點(diǎn)的吸光度(OD)值，繪制增殖曲線。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

取轉(zhuǎn)染后24 h的各組細(xì)胞,接種培養(yǎng)于6孔板中,孔板底部預(yù)先畫好標(biāo)記線,待細(xì)胞長到完全融合后,用10 μl的滅菌槍頭垂直培養(yǎng)孔底面中央用力劃直線沿直線劃痕,PBS沖洗2次后繼續(xù)培養(yǎng),記錄劃痕后0 h和24 h顯微鏡劃痕愈合情況,劃痕愈合率(%)=[(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度]×100%,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

基質(zhì)膠均勻涂抹Transwell小室上室,過夜成膜。次日收集轉(zhuǎn)染24 h的LNCaP細(xì)胞以無血清培養(yǎng)基重懸制備單細(xì)胞懸液,取200 μl含2×105個細(xì)胞的單細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室,小室下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室,棉簽輕輕擦棄小室上室的細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,染色,風(fēng)干,顯微鏡下觀察,并隨機(jī)取5個高倍視野計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測mTOR的表達(dá)

取對數(shù)生長期LNCaP細(xì)胞，常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，以BCA法定量蛋白濃度。每個樣本取200 μl樣品，10% SDS-PAGE分離，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%封閉液4 ℃封閉1 h后，TBS緩沖液漂洗3遍，加入一抗mTOR和GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBS緩沖液漂洗3遍，加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育45 min后，ECL顯影液顯影，Quality One軟件分析條帶灰度，以mTOR與GAPDH灰度的比值表示相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析非參數(shù)數(shù)據(jù);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染前后miR-100-5p在LNCaP和RWPE-1細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染前qRT-PCR結(jié)果顯示miR-100-5p在前列腺癌細(xì)胞LNCaP的表達(dá)水平較RWPE-1細(xì)胞低(P<0.01,見圖1A)。miR-100-5p mimics轉(zhuǎn)染后LNCaP細(xì)胞中miR-100-5p的表達(dá)明顯高于NC-mimics組(P<0.01,見圖1),表明miR-100-5p mimics轉(zhuǎn)染效率較高。

與各自對照組相比較,**P<0.01

2.2 轉(zhuǎn)染后LNCaP細(xì)胞的增殖活性

CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)顯示LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics組48,72,96 h時(shí)OD值明顯低于NC-mimics組(P<0.01,見圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)染后LNCaP細(xì)胞的遷移能力

與NC-mimics組比較,miR-100-5p mimics組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的劃痕愈合率明顯下降(P<0.01,見圖3,4),提示轉(zhuǎn)染后LNCaP細(xì)胞的遷移能力明顯降低。

2.4 轉(zhuǎn)染后LNCaP細(xì)胞的侵襲能力

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-100-5p mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于NC-mimics組(P<0.01,見圖5),提示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲能力明顯下降。

2.5 生物學(xué)信息法預(yù)測miR-100-5p的靶基因

應(yīng)用生物學(xué)信息法預(yù)測miR-100-5p可能靶基因,查閱miRand(http://www.microrna.org),預(yù)測mTOR可能是miR-100-5p的作用靶基因,miR-100-5p與mTOR的3′UTR區(qū)存在種子序列互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(見圖6)。

與NC-mimics組比較,**P<0.01

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力Figure 3 Cell migration ability detected by cell scratch experiment

與NC-mimics組相比較,**P<0.01

2.6 轉(zhuǎn)染后LNCaP細(xì)胞的mTOR mRNA和蛋白的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示miR-100-5p mimics轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞mTOR mRNA的表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染NC-mimics細(xì)胞(P<0.01,見圖7)。Western blot 顯示100-5p mimics轉(zhuǎn)染后LNCaP細(xì)胞mTOR 蛋白的表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染NC-mimics細(xì)胞(P<0.01,見圖7)。

圖5 轉(zhuǎn)染后LNCaP細(xì)胞侵襲能力的改變Figure 5 Invasion ability of cells detected by Transwell invasion assay

圖6 miR-100-5p與mTOR的3′UTR區(qū) 的結(jié)合序列Figure 6 The binding sequence of miR-100-5p with the 3′UTR region of mTOR

圖7 轉(zhuǎn)染后LNCaP細(xì)胞中mTOR mRNA和蛋白水平的表達(dá)Figure 7 Expression of mTOR mRNA and protein in LNCaP cells after transfected with miR-100-5p mimics

3 討論

miRNA是一類19-24 nt左右的ncRNA。miRNA可與多個靶mRNA3′UTR結(jié)合并調(diào)控基因表達(dá),導(dǎo)致靶基因異常表達(dá)[9,10]。miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián),研究證實(shí)miRNA在腫瘤組織中差異性表達(dá),可以作為腫瘤早期檢測、分型及預(yù)后的生物標(biāo)志物[11,12]。研究發(fā)現(xiàn)miR-100-5p等在前列腺癌中表達(dá)下調(diào),被認(rèn)為是抑癌基因在前列腺癌的發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[13]。有報(bào)道稱,miR-100-5p的缺失導(dǎo)致AGO2表達(dá)水平上調(diào),進(jìn)而發(fā)生癌細(xì)胞的遷移、侵襲、EMT,從而促進(jìn)前列腺癌的轉(zhuǎn)移[14]。本研究通過qRT-PCR檢測前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和人正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1中miR-100-5p的表達(dá),miR-100-5p在LNCaP細(xì)胞中表達(dá)明顯降低,提示miR-100-5p在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能也起著抑癌基因的作用。細(xì)胞無限增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特性,在對多種惡性腫瘤的研究中均發(fā)現(xiàn)miR-100-5p能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等腫瘤生物學(xué)行為[15,16]。

為了進(jìn)一步研究miR-100-5p對LNCaP細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-100-5p mimics轉(zhuǎn)染至LNCaP細(xì)胞,成功上調(diào)細(xì)胞中miR-100-5p的表達(dá);CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-100-5p的上調(diào)能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性、遷移和侵襲能力,進(jìn)一步證實(shí)miR-100-5p作為抑癌基因能夠抑制PCa的進(jìn)展。

miR-100-5p抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的下游分子通路尚不完全明確,為了研究miR-100-5p調(diào)控LNCaP細(xì)胞的下游靶基因,應(yīng)用生物學(xué)信息法預(yù)測mTOR可能是miR-100-5p的作用靶基因,因?yàn)閙iR-100-5p與mTOR的3′UTR區(qū)存在種子序列互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其通過調(diào)控蛋白質(zhì)合成參與生理進(jìn)程和病理反應(yīng),并與癌癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[17]。mTOR信號通路主要調(diào)控參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞增殖和代謝,是僅次于p53通路的人類癌癥中第二大通路[18]。本研究中,應(yīng)用qRT-PCR和Western blot發(fā)現(xiàn),上調(diào)LNCaP細(xì)胞中miR-100-5p表達(dá)后,細(xì)胞中mTOR mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯下降,提示miR-100-5p在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用與靶向調(diào)控mTOR基因有關(guān),上調(diào)miR-100-5p的表達(dá)能夠明顯抑制mTOR基因的表達(dá)。mTOR 是自噬信號通路中的主要靶標(biāo),在細(xì)胞生長、增殖、分化、細(xì)胞周期調(diào)控等方面起重要作用?；诒狙芯拷Y(jié)果推測miR-100-5p可能通過靶向mTOR誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,miR-100-5p在前列腺癌細(xì)胞系LNCaP中低表達(dá),且miR-100-5p能夠抑制LNCaP細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力,其機(jī)制與下調(diào)mTOR基因的表達(dá)有關(guān),可能成為未來PCa靶向治療的分子靶點(diǎn)。