安改麗,劉 屹,喻 鳳,陳小龍,郭 維(陜西省人民醫(yī)院腫瘤內科,西安 70068;陜西省人民醫(yī)院影像科;陜西省人民醫(yī)院教學科;通訊作者,E-mail:viking6@6.com)

文獻中已有學者設計合成了HER2靶向探針,用于不同成像模式下HER2陽性腫瘤的成像,包括使用不同的放射性標記物(18F、89Zr、68Ga)進行PET顯像[5-8],用SPIO顆粒進行MRI顯像[9,10]。也有學者設計了多模態(tài)分子探針用于顯示EGFR陽性腫瘤[10,11],檢測腫瘤血管生成[12-14],或評價抗癌藥物運送效率[12],但迄今為止,適用于HER2陽性乳腺癌PET-CT/MRI顯像的多模態(tài)探針尚未見報道。本研究在文獻基礎上,擬合成多模態(tài)HER2靶向探針,使其能夠應用于PET-CT及MRI兩種影像學模式,使腫瘤細胞表面HER2受體特異性顯影,達到無創(chuàng)檢測HER2的目的,使HER2陽性乳腺癌能夠被早期、快速、特異性地診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株SK-BR3(購自上海生科院細胞資源中心);超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIO)(中科雷鳴北京有限公司);PAA(美國Sigma公司);Herceptin(羅氏制藥有限公司);噻唑蘭(MTT,美國Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO,上海浩然生物技術有限公司);4%多聚甲醛(北京鼎國昌盛生物技術有限公司);RPMI-1640(美國GIBCO公司);胎牛血清(美國GIBCO公司)。

1.2 多模態(tài)HER2納米靶向探針的制備

1.2.1 SPIO-Herceptin的制備 參照文獻[10,11],使用高熱分解法合成生物相容性SPIO,并用聚丙烯酸(polyacrylic acid,PAA)對其進行表面功能化修飾,過程如下:

稱取NaOH于100 ml三口瓶中,加入20 ml三乙二醇。磁力攪拌,通氬氣(Ar2)15 min后,加熱到120 ℃并保持10 min,然后將溫度保持在70 ℃待用。取適量PAA和FeCl3于100 ml三口瓶中,加入20 ml三乙二醇。在機械攪拌的條件下通Ar215 min,加熱升溫至220 ℃,然后加入4 ml NaOH溶液,反應1 h后,冷卻至室溫。通過乙醇洗滌和磁分離進行提純,真空干燥,得到SPIO-PAA。將SPIO-PAA與Herceptin進行化學偶聯,合成SPIO-Herceptin,分裝于EP管內,4 ℃保存。

1.2.2 SPIO-Herceptin-NOTA-AI18F的制備 參照文獻[10,11],將適量p-SCN-Bn-NOTA加入到SPIO-Herceptin溶液中,室溫反應10 h,通過水洗滌和磁分離進行提純,得到SPIO-Herceptin-NOTA。將2 mmol/L AlCl3和2 mmol/L K18F溶液混合,將SPIO-Herceptin-NOTA加入到上述溶液中,37 ℃孵化30 min,通過水洗滌和磁分離進行提純,得到SPIO-herceptin-NOTA-AI18F。PBS緩沖液對所提純物進行洗脫,每0.5 ml洗脫液收集1管,共20管。同法制備不含SPIO微球的Herceptin-NOTA-AI18F作對照。PBS設定為空白對照。

1.3 SPIO-PAA的一般特征檢測

1.3.1 理化性質檢測 使用超純水溶解制備好的SPIO-PAA,目測法來觀察其溶液顏色及透明度,取適量樣品并使用標準pH試紙測定pH值。

1.3.2 透射電鏡檢測形態(tài) 取適量SPIO-PAA并充分研磨,使用乙醇作為分散劑,超聲分散后取2 μl懸浮液滴于銅網上,自然干燥后通過高分辨透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米顆粒的大小及形態(tài)。

1.3.3 動態(tài)光散射儀檢測 分別取1%SPIO-PAA及SPIO-herceptin-NOTA-AI18F水溶液,加入石英比色皿中,在波長633 nm的He/Ne激光下對樣品進行掃描測定。

1.3.4 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F磁性分析 取10 μg SPIO-herceptin-NOTA-AI18F裝入長約7 mm的棉簽管中,兩端封口后于振動樣品磁強記樣倉中逐步增加磁場強度,觀察磁化曲線,記錄數據,計算磁飽和強度和剩磁。

1.3.5 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F脂水分配系數測定 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F的親水性程度采用脂水分配系數來評估。分別取0.5 ml的正辛醇和PBS緩沖液,充分混勻,取10 μl SPIO-herceptin-NOTA-AI18F加入裝有上述混合液的EP管中,室溫下振蕩3-5 min,1 500 r/min離心5 min。分別在上(有機相,正辛醇)下(水相,PBS)相中各取0.1 ml作為一個樣品,共3個樣品。放射性活度通過全自動γ放射免疫計數儀來測定,另取空管進行背景值計數,計算脂水分配系數。

1.3.6 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F體外穩(wěn)定性試驗 在裝有100 μl PBS的EP管中加入新鮮制備的SPIO-herceptin-NOTA-AI18F溶液,置于37 ℃冰箱中,分別于1,2,3,4 h后取出,Radio-TLC法測定其放射化學純度,評估其在PBS中的穩(wěn)定性。同法操作流程評估其在胎牛血清中的穩(wěn)定性。

1.4 細胞培養(yǎng)及荷瘤小鼠模型構建

人乳腺癌細胞SK-BR3在添加10%胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。選取雌性無胸腺裸鼠16只,4-6周齡,體質量在20 g左右,分為實驗組(HER2陽性)和對照組(HER2陰性),每組8只,依次編號和標記;無菌條件下,取含有SK-BR3細胞的細胞懸液100 μl(含3×106個細胞)分別接種于實驗組每只裸鼠右前肢背側皮下,接種1周后用于后續(xù)動物實驗。

1.5 MTT法檢測納米顆粒對細胞增殖的影響

將SPIO-herceptin-NOTA-AI18F納米顆粒配制為如下濃度:200.0,100.0,50.0,25.0,12.5,6.25,3.2 mg/L,加入含SK-BR3細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h,后加入MTT 20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,加入100 μl DMSO,酶標儀測定吸光度值(A),陰性對照組單純加入培養(yǎng)液,分別計算細胞相對增殖率(RGR)。

1.6 體外細胞特異性結合實驗

選對數生長期的SK-BR3細胞,設置4個時間點組(30 min,1 h,2 h和4 h),每組在EP管中裝有400 μl含有1%BSA的RPMI-1640培養(yǎng)液及計數為2×105個SK-BR3乳腺癌細胞。每管中加入SPIO-herceptin-NOTA-AI18F溶液50 μl。震蕩1 min,37 ℃水浴箱中培養(yǎng)。分別在預設的4個時間節(jié)點取出相應的細胞培養(yǎng)管,加入500 μl預冷的PBS,800 r/min離心5 min,棄上清,PBS洗滌兩遍,γ計數儀測量每管的放射性計數,計算不同時間點的細胞結合率,細胞結合率=(反應管計數-本底計數)/標準管計數×100%。

1.7 荷瘤鼠的體內分布

荷瘤鼠尾靜脈注射一定劑量SPIO-herceptin-NOTA-AI18F,4 h后取血,斷頸處死。取適量腫瘤組織、肺、心臟、肝、胃、脾臟、腸管、腎、股骨、肌肉,生理鹽水清洗干凈后稱重,衰減校正后分別計算各個標本單位組織中放射性計數與注入總放射性計數的比例(%ID/g)。

1.8 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析,結果使用均數±標準差表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SPIO-PAA和SPIO-herceptin-NOTA-AI18F的形態(tài)及物理性質

本研究成功構建靶向HER-2的多模態(tài)納米分子探針,合成的SPIO-PAA可溶于超純凈水中,pH值約為6.5。高分辨透射電子顯微鏡(TEM)下觀察到該納米顆粒大小均一,分散性良好,隨機選取100個SPIO-PAA顆粒并計算其核心粒徑,繪制如下直方圖,該納米顆粒的核心粒徑集中于14-16 nm(見圖1)。動態(tài)光散儀測得的SPIO-PAA及SPIO-herceptin-NOTA-AI18F的平均水合徑粒分別為46.8 nm和54.35 nm(見圖2)。

圖1 TEM所示SPIO-PAA顆粒粒徑分布圖Figure 1 The particle size distribution of SPIO-PAA by TEM

圖2 動態(tài)光散射儀結果Figure 2 The average hydrodynamic sizes of SPIO-PAA and SPIO-herceptin-NOTA-AI18F measured by dynamic optical dispersive instrument

2.2 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F納米顆粒的磁性分析

外加磁場為0時,測試的納米顆粒幾乎沒有剩磁,隨著外部磁場強度的不斷增大,其磁化強度也不斷增大;當外加磁場強度達到1 800 Oe時,納米顆粒的磁化強度增速趨于平緩,逐漸達到飽和狀態(tài)(見圖3)。經測試,SPIO-herceptin-NOTA-AI18F的飽和磁化強度為50.38 emu/g,與文獻報道的結果相近,說明該材料具有超順磁性,具備成為MRI顯影劑的潛力。

圖3 SPIO-Herceptin-NOTA-AI18F的磁滯回曲線Figure 3 The saturation magnetization of SPIO-Herceptin-NOTA-AI18F

2.3 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F脂水分配系數測定

經計算,SPIO-Herceptin-NOTA-AI18F的LogP=log[(正辛醇相γ計數-背景平均γ計數)/(PBS相γ計數-背景平均γ計數)]=-2.58±0.21(見表1),說明此探針呈現明顯的親水性。

表1 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F的脂水分配系數Table 1 Fat water distribution coefficient of SPIO-herceptin-NOTA-AI18F

2.4 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F體外穩(wěn)定性分析

在恒溫條件下(37 ℃),SPIO-herceptin-NOTA-AI18F在PBS緩沖液中孵育4 h放化純度在75%左右,在胎牛血清中孵育4 h放化純度在80%左右(見圖4),說明SPIO-herceptin-NOTA-AI18F在體外孵育4 h基本是穩(wěn)定存在的。其中,PBS緩沖液是模擬活體內堿性微環(huán)境,胎牛血清是模擬活體內的血液環(huán)境。

圖4 SPIO-Herceptin-NOTA-AI18F在PBS及胎牛血清中的穩(wěn)定性Figure 4 The stability of SPIO-Herceptin-NOTA-AI18F in PBS and fetal bovine serum

2.5 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F對SK-BR3細胞增殖的影響

不同濃度(200.0,100.0,50.0,25.0,12.5,6.25,3.2 mg/L)的SPIO-herceptin-NOTA-AI18F與乳腺癌細胞作用后,細胞相對增殖率(RGR)分別為(99.28±13.21)%,(99.19±11.35)%,(99.03±12.57)%,(95.28±12.29)%,(94.29±12.46)%,(91.78±14.34)%,(90.27±13.18)%(見圖5),提示該納米顆粒對乳腺癌SK-BR3細胞毒性小。

圖5 不同濃度SPIO-herceptin-NOTA-AI18F對SK-BR3細胞的毒性作用Figure 5 Toxic effects of SPIO-herceptin-NOTA-AI18F on SK-BR3 cells

2.6 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F與SK-BR3細胞特異性結合

SPIO-herceptin-NOTA-AI18F與SK-BR3細胞的結合呈時間依賴性,符合抗原-抗體結合的反應規(guī)律,其結合率在30 min時為(7.10±0.30)%,1 h時為(12.30±1.37)%,2 h時為(15.02±2.09)%,4 h時為(18.02±1.84)%(見圖6)。

圖6 SK-BR3細胞與SPIO-herceptin-NOTA-AI18F共培養(yǎng)不同時間結合率的變化Figure 6 Changes of the binding rate between the cells and the nanoprobes after coculture for different time

2.7 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F在荷瘤小鼠體內的生物分布

尾靜脈注射SPIO-herceptin-NOTA-AI18F后,該納米顆粒主要分布在腫瘤組織、血液、肝臟、腎臟和脾臟,肌肉、骨骼中攝取較少。隨著時間的延長,各組織器官的放射性逐漸降低,下降最快的是血液,其次為肝臟和腎臟,主要經肝臟代謝,腎臟排泄,10 min時該納米顆粒的放射性計數在肝臟為(18±0.76)%ID/g、腎臟為(6.5±0.61)%ID/g,48 h時上述器官的放射性均明顯下降,肝臟為(3±0.43%ID/g,腎臟為(1.2±0.02)%ID/g,分別降低了83.86%和81.53%(圖7)。

圖7 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F在荷瘤小鼠體內的生物學分布Figure 7 Biological distribution of SPIO-herceptin-NOTA-AI18F in tumor-bearing mice

3 討論

納米科技近年來在生物診斷、靶向藥物傳遞、基因治療等方面發(fā)揮了重要作用,其在分子影像研究中具有獨特的優(yōu)勢:首先納米顆粒(NPs)體積小(比正常細胞小2-4個數量級),能夠在其表面進行多種配體功能化,提高對受體的靶向識別能力,實現分子特異性成像;其次納米顆粒表面積與體積比較大,可與其他對比劑通過化學鍵結合,為實現多模態(tài)成像提供了平臺。超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIONs)是臨床醫(yī)學研究上目前應用較多的納米材料之一,SPIO-NPs直徑小(60-150 nm),穿透力強,具有良好的生物相容性、穩(wěn)定性及生物降解性,代謝后進入正常血漿鐵池,且弛豫率為同樣條件下釓離子的7-10倍,在低濃度條件下即能夠形成T2WI陰性信號對比,已成為廣泛應用的MR分子成像標記物[10,12-14]。文獻中分子探針常用的放射性標記物為64Cu、18F、68Ga、89Zr[5-8,14,15]等,其中18F是臨床最常用的PET-CT顯像劑,對回旋加速器能量要求低,容易獲得,且產率較高,其半衰期只有110 min,體內代謝快,適合作為分子探針進行核素顯像;赫賽汀是抗HER2的單克隆抗體,能夠實現與腫瘤細胞表面HER2受體特異性結合,因此能夠作為載體,將探針導向靶點。本研究通過特定的系列化學反應,最終得到18F標記的HER2靶向磁性納米顆粒SPIO-herceptin-NOTA-AI18F,其具有良好的理化性質和超順磁性,滿足PET/CT和磁共振雙模態(tài)檢查的需求。18F標記后具有較高的放射化學純度和良好的穩(wěn)定性。體外實驗顯示,該納米顆粒與SK-BR3細胞膜上特異性抗原有高度親和力,荷瘤小鼠體內實驗顯示放射性主要濃聚于肝臟和脾臟,說明該探針主要為肝脾攝取,隨時間延長,放射性攝取在10 min后達到峰值,其后逐漸下降,其在體內的代謝及排泄與文獻報道一致[16-18],這些特征符合抗體在活體內的分布及代謝規(guī)律,為后續(xù)體內分子影像學研究提供物質基礎。HER2靶向納米探針基礎上進行的多模態(tài)分子成像將能夠活體檢測HER2表達水平,有助于臨床實現HER2陽性乳腺癌的術前無創(chuàng)性診斷,從而早期評價預后,為患者創(chuàng)造最佳治療時機。