古麗扎熱葉·艾庫拉，譚 遙，帕力達·阿皮孜阿吉，*

(1．新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺放療科，新疆 烏魯木齊 830011；2．新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸腹放療科，新疆 烏魯木齊 830011)

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)為超過200個核苷酸的非編碼RNA類型，具有很少或沒有蛋白質編碼能力，在過去幾年中，已證明lncRNA參與許多生理和病理過程[1-2]并發(fā)現(xiàn)異常表達的lncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移及預后密切相關。食管癌的發(fā)病分布具有明顯地區(qū)差異，新疆哈薩克族食管癌發(fā)生率明顯高于同區(qū)生活的其他民族[3]。目前食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)確切的發(fā)病機制很大程度上仍然是未知的，有研究[2]表明有些lncRNA參與了食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展，但關于lncRNA在食管鱗癌中的差異表達研究較少，尤其在哈薩克族食管鱗癌中研究空白。本研究選取食管癌高發(fā)病區(qū)新疆哈薩克族食管鱗癌作為研究對象，利用lncRNA表達譜芯片對食管鱗癌組織及癌旁組織中對lncRNA表達譜進行分析，以篩選差異表達的lncRNA并分析其在ESCC發(fā)生發(fā)展中的潛在功能。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 樣本收集 收集2010年3月—2013年3月期間在新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院行根治性手術的4例哈薩克族食管癌患者的新鮮組織標本，年齡50～70歲，平均年齡60歲，臨床分期：4例患者病理分期均為Ⅱ期，病理均為鱗狀細胞癌。研究4對新鮮食管癌組織及對應癌旁組織(距腫瘤邊緣3 cm)標本并切取適量置于事先預冷的1.5 mL無RNA酶(RNase-free)EP管內(nèi)，食管組織樣本于-80℃低溫冰箱中長期保存。本實驗樣本由新疆腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.1.2 試劑及儀器 NucleoSpin?RNA clean-up試劑盒、Nucleospin?ExtractⅡ試劑盒均購自美國MACHEREY-NAGEL公司；晶芯?生物芯片通用標記試劑盒購自北京CapitalBio公司；紫外分光光度計ND-1000購自美國NanoDrop公司；Agilent芯片掃描儀G2565CA購自美國Agilent公司。

1.1.3 芯片 由烏魯木齊英捷領先生物技術有限公司定制的Agilent lncRNA芯片V4.0，包含34 235個mRNA檢測探針和40 916個lncRNA檢測探針。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和處理 取一份鋁箔紙包埋的冰凍組織標本(50～100 mg)，在液氮冷凍狀態(tài)下磨碎，加入Trizol試劑采用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀方法提取組織總RNA，參照試劑使用說明書或實驗室改進方法。經(jīng)DNA酶處理后，測定總RNA濃度，以瓊脂糖凝膠電泳、溴乙錠(替代品)顯色和紫外成像質檢(18和28 S RNA)。嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書對RNA進行逆轉錄，合成cDNA，并對cDNA進行純化。

1.2.2 芯片雜交 純化后的cDNA體外轉錄合成cRNA，對產(chǎn)物進行熒光標記，使用Agilent雜交盒，與lncRNA芯片進行雜交，采用Agilent芯片掃描儀對清洗后的芯片進行掃描，再使用配套軟件提取lncRNA表達水平的數(shù)據(jù)，Agilent GeneSpring軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析，差異基因篩選標準為：差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)在2.0倍以上，并且P＜0.05，從而篩選出癌組織和癌旁組織之間差異表達的lncRNA，同時對篩選出的差異表達基因做層次聚類分析。

1.2.3 食管癌相關的lnc RNA功能分析 結合lncRNA及其臨近靶基因mRNA的表達特征，構建lncRNAmRNA共表達網(wǎng)絡，對差異表達lncRNA進行靶基因預測，通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫找出靶基因相關的GO類別和信號通路。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計處理，癌組和癌旁組lncRNA指標之間采用配對t檢驗，GO和通路分析采用超幾何分布檢驗，差異倍數(shù)通過BH方法矯正，差異倍數(shù)越大，說明兩個樣品之間的差異越大，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 散點圖

火山圖是可以直觀反映差異基因的數(shù)量、顯著性和可靠性。簡單來說，圖中各點越靠近左上角和右上角，則其差異越顯著，篩選閾值默認設置為P＜0.05。根據(jù)芯片數(shù)據(jù)結果分析得到的差異倍數(shù)與P值共同繪制的火山圖見圖1。食管鱗癌及其癌旁對照組織lncRNA差異表達聚類分析結果見圖2。

2.2 差異表達lnc RNA的篩選

選出食管鱗癌與其癌旁組織中差異表達的lncRNA，癌組織和癌旁組織之間差異表達lncRNA共有318個，與癌旁組織相比，癌組織中，125個lncRNA表達下調(diào)；其中下調(diào)95%以上的lncRNA為17個(見表1)；193個lncRNA表達上調(diào)，其中上調(diào)10倍以上的lncRNA為27個(見表2)。

2.3 差異表達lnc RNA功能預測

通過靶基因預測發(fā)現(xiàn)差異表達的lncRNA有10個靶基因，利用KEGG和GO數(shù)據(jù)庫對靶基因進行富集分析和通路分析。富集分析結果(表3)顯示，8個靶基因有5個GO類別，包括細胞外區(qū)、內(nèi)肽酶活性、細胞器、蛋白質代謝途徑、細胞外等，對靶基因的調(diào)控方式均為反式-調(diào)控方式。通路分析結果(表4)顯示靶基因參與2條信號通路途徑，包括軸突導向信號通路途徑和ECM受體相互作用信號通路途徑。

標注為紅色的是上調(diào)基因，標注為綠色的是下調(diào)基因，標注為藍色的是無顯著差異基因.圖1 食管鱗癌及其癌旁對照組織差異表達lncRNA火山圖

每一列代表一個樣本，每一行代表一個基因在不同樣本中的表達程度，紅色表示相對高表達，藍色表示相對低表達.圖2 食管鱗癌及其癌旁對照組織差異表達lncRNA聚類圖

3 討論

長鏈非編碼RNA已成為許多癌癥中關鍵的生物標志物和調(diào)節(jié)因子，因其在多種生物過程中的重要作用而受到廣泛的關注，目前，眾多研究結果已證實lncRNA可在轉錄水平、轉錄后水平、表觀遺傳學、與DNA、RNA、蛋白質分子相互結合，在多個重要節(jié)點調(diào)控腫瘤的進展。lncRNA異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移信息相關。已研究顯示，多種惡性腫瘤如結直腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌的發(fā)生和發(fā)展中l(wèi)ncRNA發(fā)揮著重要的作用[4-7]。劉長等[8]對結腸癌組織中篩選出928條差異表達的lncRNA，表明lncRNA與結腸癌的發(fā)生密切相關。在ESCC中，YAO等[9]發(fā)現(xiàn)lncRNA參與了癌癥的免疫應答、細胞分化和細胞增殖等生物學過程。李夏君等[10]研究發(fā)現(xiàn)江蘇淮安食管鱗癌及癌旁組織篩選出表達差異的lncRNA共1 019個，其中399個上調(diào)，620個下調(diào)。GO分析發(fā)現(xiàn)這些lncRNA可能調(diào)控的mRNA主要參與了細胞周期、細胞分化、蛋白酶活動等過程。李光華等[11]對新疆漢族食管癌組織中篩選出差異表達的lncRNA 680個，其中161個lncRNA表達上調(diào)，519個lncRNA表達下調(diào)。與李夏君等研究結果基本相似，因此本研究以新疆哈薩克族食管癌作為研究對象，通過基因芯片技術篩選出差異表達的lncRNA共318個，其中193個lncRNA表達上調(diào)，125個lncRNA表達下調(diào)，利用lncRNA-mRNA網(wǎng)絡對差異表達的lncRNA進行靶基因預測，有10個靶基因，所有l(wèi)ncRNA均通過反式調(diào)控方式對靶基因進行調(diào)控，GO和通路分析表明這些差異表達基因參與2條可能與食管鱗癌相關的信號通路，包括軸突導向信號通路和ECM受體相互作用信號通路途徑。富集分析發(fā)現(xiàn)共有5個GO類別，其中細胞成分有3個，生物過程有1個，分子功能有1個。已研究結果報道，在食管鱗癌中發(fā)現(xiàn)TNXB和ABLIM1基因表達下調(diào)，對食管鱗癌具有抑癌作用，與食管鱗癌的發(fā)生及發(fā)展密切相 關[12-13]，本研究結果發(fā)現(xiàn)這兩種基因分別參與軸突導向信號通路和ECM受體相互作用信號通路途徑，但其在食管鱗癌中表達水平需要進一步驗證。

表1 與癌旁組織相比食管鱗癌組織中表達下調(diào)95%以上的lncRNA

表2 與癌旁組織相比食管鱗癌組織中表達上調(diào)10倍以上的lncRNA

表3 食管鱗癌差異表達lnc RNA靶基因預測及富集分析

表4 食管鱗癌差異表達lncRNA靶基因KEGG通路分析

目前許多研究表明lncRNA的已知功能不是簡單的信息傳遞分子，它們是具有復雜的調(diào)控機制的分子，其延伸范圍很廣遠超出我們的預測。盡管lncRNA不能編碼蛋白質，但它們可以向下游傳遞信息并調(diào)控基因表達，所以在診斷和治療上，他們作為信息傳導分子可能比蛋白質更有敏感性和特異性。

本研究結果初步從新疆哈薩克族食管鱗癌組織中篩選出差異表達的lncRNA指標，但與既往研究結果相比，差異表達的lncRNA數(shù)量及靶基因差異較大，靶基因參與的信號通路也不盡相同，說明其差異表達基因群存在地區(qū)或人群差異，提示基于不同區(qū)域或不同族群遺傳背景的篩查分析的重要意義。目前本研究只篩選出與新疆哈薩克族食管鱗癌相關的lncRNA指標，但其在食管鱗癌中的表達模式和生物學功能以及食管鱗癌中的診斷價值需要進一步探討。