王耀杰，相曉晗，韓麗娜，李 軍，霍炳杰，趙連梅，*

(1．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北石家莊 050011；2．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050011；3．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院中醫(yī)科，河北 石家莊 050011)

地錦草(Euphorbia humifusa)，是屬于大戟科大戟屬地錦草種的一種廣泛分布于中國(guó)各地區(qū)的雙子葉植物。地錦草是中國(guó)藥典中記載的一種重要藥材，可用于治療痢疾、腸炎、黃疸和創(chuàng)傷性出血[1-2]。在既往的植物化學(xué)研究中，研究者從地錦草中分離出多種生物活性化合物，包括甜菜堿脫氫羅漢酸甲酯、黃酮苷、芹菜素、單寧、α-吡咯烷酮類和羊毛甾烷三萜[3-4]等，這些化合物表現(xiàn)多種藥理作用，包括抗真菌、抗炎、血管舒張以及抗病毒等[4-6]。研究表明，該植物的主要生物活性成分是黃酮、酚類[7]、三萜類化合物[8-9]和倍半萜[6]。在傳統(tǒng)的維吾爾醫(yī)學(xué)中，地錦草主要用于治療皮膚病[3]。藥理學(xué)研究表明，地錦草還具有抗炎[4]、抗氧化[5]、降血脂和降血糖[7]等作用，并且作為中藥提取物，地錦草應(yīng)用于臨床上具有副作用小、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。

癌癥是世界范圍內(nèi)的一個(gè)威脅人們健康的主要因素[10]。胃癌(gastric carcinoma，GC)是全球第五大常見癌癥和癌癥死亡的第二大原因，是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高轉(zhuǎn)移率，全世界每年約有幾十萬人因胃癌而死亡[11-12]。目前胃癌的治療是以手術(shù)為主，放化療為輔的綜合治療，盡管近年來在胃癌診斷和治療方面都取得了重要進(jìn)展，但胃癌的5年生存率，尤其是轉(zhuǎn)移性胃癌患者，仍然很低，亟待研究開發(fā)出新的有效治療措施和藥物，不斷探索新的胃癌治療方案。《中藥學(xué)》記載地錦草對(duì)痢疾、胃炎、便血等胃腸道疾病具有明顯的治療效果，最近有研究證明地錦草還具有抗癌[6]作用，并且已經(jīng)在宮頸癌[16]和肝癌[24]等癌癥中得到證實(shí)，但未見地錦草應(yīng)用于胃癌的研究報(bào)道。因此本課題組擬研究地錦草乙醇提取物(ethanol extract from Euphorbia humifusa，EEEH)對(duì)胃癌細(xì)胞的作用，為開發(fā)胃癌治療新藥物提供新思路。本研究還深入探討了EEEH對(duì)增殖相關(guān)蛋白PCNA、抗凋亡相關(guān)蛋白BCL-2和BCL-XL以及促凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9的影響，初步研究地錦草乙醇提取物對(duì)體外胃癌細(xì)胞增殖活性的影響及其作用機(jī)制，為地錦草乙醇提取物應(yīng)用于胃癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

人胃癌細(xì)胞株BGC823、MGC803、SGC7901以及AGS均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心，并于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心保存。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Biological Industries(BI)公司，MTS細(xì)胞增殖分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，蛋白上樣緩沖液購(gòu)自Takara公司，細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，兔抗人BCL-2、BCL-XL、PCNA、caspase-8、caspase-9、caspase-3和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2 地錦草乙醇提取物的制備

地錦草生藥購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥房，秤取地錦草40 g，置于經(jīng)硫酸浸泡，高壓處理過的錐形瓶中，并添加400 mL的75%乙醇，蓋緊瓶塞，浸泡過夜。第二日，將錐形瓶置于100℃水浴鍋中并與回流裝置連接，蒸餾3 h，常溫冷卻，棄殘?jiān)?，取上清，濾紙過濾3次，12 000 r/min，5 min離心，經(jīng)旋轉(zhuǎn)凍干成粉后，取適量地錦草提取物，DMSO溶解，得到地錦草乙醇提取物原液，用不含牛血清和雙抗的1640培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，一次性濾器過濾2次，備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存于-80℃胃癌細(xì)胞株迅速移至37℃水浴箱中融化，細(xì)胞懸液移入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素-慶大霉素(三抗)的RPMI-1640培養(yǎng)基的無菌離心管內(nèi)，1 000 r/min，3 min離心，倒掉上清，吸取適量培基重懸，移至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，用胰蛋白酶消化細(xì)胞后傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 預(yù)實(shí)驗(yàn)

由于地錦草乙醇提取物相關(guān)文獻(xiàn)較少，研究人員的提取方式各異，因此，在正式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，我們進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定地錦草乙醇提取物對(duì)胃癌細(xì)胞株的最佳作用濃度。我們將用DMSO溶解的EEEH原液，用不含牛血清和不含三抗的1640培基進(jìn)行稀釋，稀釋成多個(gè)濃度，用不同濃度的EEEH分別處理胃癌細(xì)胞，利用MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy methox yphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度EEEH(62.5、125、250和500μg/mL)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用，選取最終受試物濃度，以0.05%的DMSO作為溶劑對(duì)照。

1.5 MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞存活率

胰蛋白酶消化細(xì)胞，培基終止消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，1 000 r/min離心3 min，倒掉上清，加入少量培基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，在96孔板中加入5×103個(gè)細(xì)胞，37℃孵育4 h，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組各孔分別加入不同濃度的地錦草乙醇提取物(62.5、125、250和500μg/mL)；空白對(duì)照孔加入完全培養(yǎng)基；溶劑對(duì)照孔加入0.05%的DMSO；每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)處理24、48、72 h后加入MTS試劑，反應(yīng)2 h，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)492 nm波長(zhǎng)處各孔的光密度D(492)值，計(jì)算抑制率，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)柱狀圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

將用不同濃度(62.5、125、250和500μg/mL)的地錦草乙醇提取物處理24、48、和72 h的胃癌細(xì)胞BGC823、MGC803、SGC7901以及AGS分別放置于倒置相差顯微鏡下，觀察胃癌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性以及核仁的變化并拍照記錄。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞周期分布

用胰蛋白酶消化經(jīng)不同濃度(62.5、125和250μg/mL)的地錦草乙醇提取物處理24 h的各組胃癌細(xì)胞，培基終止消化，離心棄上清，PBS洗滌兩次，加入1 mL PI染料和10μL滲透液，混勻后避光孵育30 min，過濾網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞的G0/G1、S和G2/M的周期分布，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞凋亡率

用胰蛋白酶消化經(jīng)不同濃度(62.5、125和250μg/mL)的地錦草乙醇提取物處理24 h的各組胃癌細(xì)胞，培基終止消化，離心棄上清，PBS洗滌兩次，加入5 μL Annexin V-PE和5μL 7-AAD，混勻后避光孵育15 min，流式細(xì)胞檢測(cè)各組的活細(xì)胞、死細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的數(shù)量，并計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 Western blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞中增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

選取胃癌細(xì)胞MGC803和AGS，用地錦草乙醇提取物濃度分別為62.5、125和250μg/mL處理胃癌細(xì)胞8、16和24 h后，RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白質(zhì)，BCA法進(jìn)行蛋白定量，每孔取蛋白樣品70μg，進(jìn)行10%SDS-PAGE，將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫下封閉2 h，TBST洗滌3次，分別加入兔抗人BCL-2、BCL-XL、caspase-8、caspase-9、caspase-3(均按1∶1 000稀釋)、PCNA(1∶2 000稀釋)和GAPDH(1∶5 000稀釋)抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入熒光二抗(1∶100 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，PVDF膜經(jīng)Odyssey紅外熒光成像儀掃描分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 地錦草乙醇提取物抑制胃癌細(xì)胞的增殖

MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示，不同濃度(62.5、125、250和500μg/mL)地錦草乙醇提取物分別處理胃癌細(xì)胞BGC823、MGC803、SGC7901以及AGS 24、48和72 h后，與對(duì)照組相比其抑制率顯著升高(均P＜0.05)，500μg/mL的地錦草乙醇提取物處理上述4種GC細(xì)胞72 h的抑制率分別可達(dá)(79.1±0.5)%、(78.3±1.1)%、(56.5±0.6)%和(47.5±1.2)%。

A：BGC823細(xì)胞；B：MGC803細(xì)胞；C：SGC7901細(xì)胞；D：AGS細(xì)胞.與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.圖1 不同濃度的地錦草乙醇提取物對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制率

2.2 地錦草乙醇提取物影響胃癌細(xì)胞形態(tài)

倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果見圖2，可見經(jīng)不同濃度(62.5、125、250和500μg/mL)地錦草乙醇提取物處理24、48和72 h的胃癌細(xì)胞BGC823、MGC803、SGC7901以及AGS的細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比有顯著差異，可見更多數(shù)量細(xì)胞皺縮，核深染，部分細(xì)胞胞膜破裂壞死。

A：BGC823細(xì)胞；B：MGC803細(xì)胞；C：SGC7901細(xì)胞；D：AGS細(xì)胞.圖2 不同濃度的地錦草乙醇提取物處理后胃癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(×10)

2.3 地錦草乙醇提取物影響胃癌細(xì)胞周期分布

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見圖3，可見經(jīng)不同濃度(62.5、125和250μg/mL)地錦草乙醇提取物處理24 h后，AGS細(xì)胞的G0/G1期比例顯著高于對(duì)照組，而S期和G2/M期細(xì)胞比例沒有明顯變化，250μg/mL地錦草乙醇提取物誘導(dǎo)的AGS細(xì)胞G0/G1期比例最高可達(dá)(68.2±0.8)%，而MGC803細(xì)胞的各期比例沒有顯著變化。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MGC803細(xì)胞的周期分布；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AGS細(xì)胞的周期分布；C：MGC803細(xì)胞的周期分布統(tǒng)計(jì)圖；D：AGS細(xì)胞的周期分布統(tǒng)計(jì)圖.與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)地錦草乙醇提取物處理24 h后的胃癌細(xì)胞周期分布

2.4 地錦草乙醇提取物誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度地錦草乙醇提取物(62.5、125、250μg/mL)處理24 h的MGC803細(xì)胞和AGS細(xì)胞的凋亡率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，250μg/mL地錦草乙醇提取物誘導(dǎo)的MGC803細(xì)胞和AGS細(xì)胞凋亡率可達(dá)(16.3±0.6)%和(19.9±1.1)%。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)(圖5)，可見細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，核深染，部分細(xì)胞胞膜破裂等凋亡樣改變，證明了流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MGC803細(xì)胞的凋亡率；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AGS細(xì)胞的凋亡率；C：MGC803細(xì)胞的凋亡率統(tǒng)計(jì)圖；D：AGS細(xì)胞的凋亡率統(tǒng)計(jì)圖.與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.圖4 地錦草乙醇提取物處理24 h后的胃癌細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

A：MGC803細(xì)胞；B：AGS細(xì)胞.圖5 地錦草乙醇提取物處理24 h后的胃癌細(xì)胞凋亡的形態(tài)觀察

2.5 地錦草乙醇提取物影響胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果見圖6，可見與對(duì)照組相比，經(jīng)地錦草乙醇提取物(62.5、125和250μg/mL)處理的胃癌細(xì)胞中PCNA、BCL-2和BCL-XL的蛋白表達(dá)水平顯著降低，caspase-8和caspase-3的蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而caspase-9的蛋白表達(dá)水平無明顯變化。

3 討論

A：Western blot檢測(cè)MGC803細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；B：Western blot檢測(cè)AGS細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；C：MGC803細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)圖；D：AGS細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)圖.與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.圖6 地錦草乙醇提取物影響胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

世界上每年有近100萬人新診斷為胃癌，超過1/3比例人數(shù)發(fā)生在中國(guó)[12-13]。根治性胃切除術(shù)是治療胃癌的唯一療法[7，14]，然而，手術(shù)創(chuàng)傷會(huì)影響到胃腸蠕動(dòng)和消化功能，還會(huì)產(chǎn)生許多不良反應(yīng)。因此近年來，中藥在癌癥的臨床治療中被廣泛應(yīng)用[15]。2017年，江濤等人證實(shí)地錦草提取物能夠抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖，其主要是通過誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡實(shí)現(xiàn)的[16]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，地錦草可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，下調(diào)腫瘤中VEGF的表達(dá)，從而抑制腫瘤血管生長(zhǎng)，改變腫瘤微環(huán)境，達(dá)到抑制腫瘤的作用[17]，并且，Soon等人研究發(fā)現(xiàn)，來自地錦草的乙酸乙酯部分通過抑制NF-κB介導(dǎo)的MMP-9的基因表達(dá)對(duì)TNFα誘導(dǎo)的高轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的侵襲具有預(yù)防作用[18]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，從地錦草中分離的異戊烯基查爾酮，在體外對(duì)人癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，并在人乳腺癌中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[19]。作為一味常用中藥地錦草還有很多其他重要的藥理作用，曹瑞珍等人發(fā)現(xiàn)，地錦草中提取的總黃酮能夠通過抗氧化作用延緩衰老[20]。還有研究證實(shí)，地錦草的黃酮類成分具有抗菌[21-22]、抗炎[23]以及抗病毒等功效[9]。綜上所述，地錦草能夠通過多種機(jī)制發(fā)揮抑制腫瘤的效應(yīng)，具有臨床應(yīng)用前景。

在本研究中，我們主要通過MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)以及Western blot實(shí)驗(yàn)探究地錦草乙醇提取物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖活性的抑制作用及其作用機(jī)制。MTS結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度(62.5、125、250和500μg/mL)地錦草乙醇提取物處理過的胃癌細(xì)胞，其增殖活力顯著降低，其中500μg/mL的地錦草乙醇提取物處理胃癌細(xì)胞72 h的抑制率高達(dá)(79.09±0.5)%，Western blot結(jié)果也證實(shí)，與對(duì)照組相比，經(jīng)地錦草乙醇提取物處理的胃癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA表達(dá)水平降低；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度(62.5、125和250μg/mL)地錦草乙醇提取物處理胃癌細(xì)胞MGC803和AGS 24 h后，其凋亡率明顯升高，Western blot結(jié)果也證實(shí)，經(jīng)地錦草乙醇提取物處理的胃癌細(xì)胞抗凋亡相關(guān)蛋白BCL-2和BCL-XL表達(dá)水平降低，而促凋亡相關(guān)蛋白caspase-8和caspase-3出現(xiàn)裂解片段，表明細(xì)胞凋亡活性增強(qiáng)，顯微鏡下可觀察到胃癌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，證實(shí)了這一結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果還顯示，地錦草乙醇提取物可將AGS細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，但對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803的周期并沒有產(chǎn)生明顯影響，我們猜測(cè)，這可能與地錦草乙醇提取物阻斷不同種類胃癌細(xì)胞系進(jìn)展的方式不同相關(guān)。以上結(jié)果證實(shí)，地錦草乙醇提取物通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并且抑制胃癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，在體外發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖活性的作用。

綜上所述，EEEH能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，影響細(xì)胞周期分布以及誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡，并且我們猜測(cè)其抑癌作用可能是通過誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡實(shí)現(xiàn)的，提示EEEH能夠通過抑制抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)凋亡蛋白的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的增殖，為進(jìn)一步探索EEEH在胃癌進(jìn)展中的作用機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。