陳子卓，徐宇航，#，姜曉旭，趙九洲，朱敬樸，鄭義鵬，吳浩芝，李文麗，王 欣，*，海春旭，*，于衛(wèi)華，*

(1．空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安710032；2．空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合診療科，陜西 西安 710032；3．空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院軍事毒理學(xué)與防化醫(yī)學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，特殊作業(yè)環(huán)境危害評估與防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032)

紫鉚花素(butein)是一種由植物中分離提取的多酚類單體化合物，是傳統(tǒng)中草藥錦雞兒和降香的主要活性成分[1]。研究發(fā)現(xiàn)，紫鉚花素具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗纖維化和抗腫瘤等生物學(xué)效應(yīng)，具有良好的藥物開發(fā)價(jià)值和前景[2]。脂多糖(lipo poly saccharide，LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要活性成分，可與巨噬細(xì)胞膜上Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)結(jié)合，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生。Janus激酶(Janus kinases，JAKs)是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，可在細(xì)胞因子作用下發(fā)生磷酸化，并通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of transcription，STATs)啟動下游靶基因，發(fā)揮生物調(diào)控作用。STAT3是STATs家族的成員，可在胞漿內(nèi)與多種細(xì)胞因子受體結(jié)合，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[3]。大量研究表明，JAK2-STAT3活化與細(xì)胞增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，在炎癥和腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。敲減JAK2和STAT3可阻斷多種炎癥因子誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化[5]。而在小鼠膿毒血癥模型中，使用JAK2-STAT3通路抑制劑，可有效阻斷核轉(zhuǎn)錄因子NFκB激活，提高小鼠的生存率[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，紫鉚花素是一種特殊的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑，可顯著阻斷表皮生長因子受體磷酸化[7-8]。那么，JAK2作為一種酪氨酸蛋白激酶，是否受到紫鉚花素調(diào)控，目前并不清楚。因此，本研究旨在探討butein是否對LPS誘導(dǎo)炎癥具有抑制作用，及JAK2-STAT3通路在其中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和試劑 C57BL/6小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供；紫鉚花素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品中心，純度98%；LPS購自Sigma公司；H2DCFH-DA熒光探針購自Invitrogen公司；小鼠TNF-α、IL-6和NO酶聯(lián)免疫試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；iNOS、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3和βactin抗體均購自Birobyt生物公司；RMPI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、紅細(xì)胞裂解液、PBS均購自上海吉諾醫(yī)藥生物技術(shù)公司。

1.1.2 儀器 垂直流超凈工作臺購自ESCO公司，型號SCV-4A1；CO2培養(yǎng)箱為Thermo公司的3111/371型號；全波段酶標(biāo)儀購自infinite公司，型號M200 PRO；流式細(xì)胞儀購自BD公司，型號Accuri C6；倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司，型號IX73；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)均購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓源性巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng) 取8周齡小鼠脛骨和股骨，無菌環(huán)境中RMPI 1640培養(yǎng)基沖洗骨髓細(xì)胞。裂解紅細(xì)胞后，用40 ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激7 d，分化為骨髓源性巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages，BMDM)，通過貼壁篩選，獲得純化BMDM。采用含10%胎牛血清(FBS)的RMPI 1640培養(yǎng)基，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞處理以及實(shí)驗(yàn)分組 BMDM采用500 ng/mL的LPS刺激12 h建立炎癥模型，受試物干預(yù)組使用5、10、20μmol/L的butein與LPS共處理，陰性對照組為20μmol/L的butein單獨(dú)處理12 h，并設(shè)立空白對照組，每組3個重復(fù)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-6和NO含量檢測采用ELISA法檢測培養(yǎng)基中TNF-α，IL-6和NO含量。細(xì)胞處理完成后，收集培養(yǎng)基，2 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞。按照試劑盒說明書加入待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃環(huán)境下孵育2 h。清洗后加入檢測工作液，孵育30 min，酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度曲線推算樣品中TNF-α和IL-6含量。

1.2.4 細(xì)胞ROS水平檢測 DCFH-DA是細(xì)胞內(nèi)ROS測定的特異性熒光探針。DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后，可被水解為無熒光的DCFH，進(jìn)而被ROS氧化為有熒光的DCF。DCF熒光越強(qiáng)，表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平越高。處理完成后，細(xì)胞中加入終濃度為10μmol/L的DCFH-DA，37℃環(huán)境下孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.2.5 Western blot測定細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá) 細(xì)胞處理完成后，RIPA裂解液裂解細(xì)胞。BCA法進(jìn)行蛋白定量，每組上樣20μg。選用10%凝膠，90 V電壓15 min，然后150 V電壓電泳約1 h結(jié)束。25 V、30 min條件下將凝膠蛋白轉(zhuǎn)至NC膜。5%BSA，37℃條件下封閉40 min。加入按要求稀釋的iNOS、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3和β-actin一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶5 000稀釋的二抗，37℃孵育60 min。TBST洗膜4次，每次15 min。凝膠成像系統(tǒng)拍照。采用Quantity One軟件分析蛋白表達(dá)變化，并以對照組為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。計(jì)算p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白條帶灰度比值變化，并以對照組為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析檢測組間方差是否齊性。兩組之間差異采用LSD t檢驗(yàn)作比較，P＜0.05表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 紫鉚花素抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞促炎因子分泌

巨噬細(xì)胞在LPS等刺激下，可釋放大量促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等。ELISA檢測BMDM培養(yǎng)液中促炎因子濃度的結(jié)果見圖1A和圖1B。我們使用500 ng/mL的LPS刺激BMDM 12 h，ELISA法測定細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后BMDM培養(yǎng)基中TNF-α和IL-6濃度顯著升高(P＜0.05)。而5、10和20μmol/L的butein共處理后BMDM培養(yǎng)基中TNF-α和IL-6濃度明顯降低。其中，20 μmol/L的butein對TNF-α分泌的抑制率為68.6%，對IL-6分泌的抑制率為84%。

A：TNF-α濃度；B：IL-6濃度.n=3.與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS單獨(dú)處理組比較，#P＜0.05.圖1 ELISA法檢測小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中的促炎因子濃度

2.2 紫鉚花素抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞NO合成

NO在機(jī)體炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在炎癥因子刺激作用下，巨噬細(xì)胞激活并釋放大量NO，具有殺菌和殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。ELISA檢測BMDM培養(yǎng)液中NO濃度的結(jié)果見圖2A。LPS刺激下BMDM培養(yǎng)基中NO濃度顯著升高，而5、10和20 μmol/L的butein共處理顯著降低NO的合成(P＜0.05)。iNOS是巨噬細(xì)胞內(nèi)調(diào)控NO合成的關(guān)鍵酶，iNOS表達(dá)和活性水平?jīng)Q定細(xì)胞NO的合成能力。Western blot檢測BMDM中iNOS表達(dá)水平的結(jié)果見圖2B，LPS活化BMDM的iNOS蛋白表達(dá)增加，而給予butein干預(yù)顯著降低iNOS表達(dá)(P＜0.05)。

2.3 紫鉚花素抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞ROS生成

在感染和炎癥條件下，巨噬細(xì)胞會釋放大量ROS，用于殺滅入侵病原菌。因此，ROS生成增多是M1型活化巨噬細(xì)胞的重要特征。DCFH-DA染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS生成的結(jié)果見圖3。LPS刺激下BMDM內(nèi)DCF信號增強(qiáng)約30倍(P＜0.05)，表明LPS誘導(dǎo)BMDM生成ROS。而使用5、10和20μmol/L的butein共處理，DCF熒光曲線明顯左移(P＜0.05)，表明butein抑制了LPS誘導(dǎo)的ROS生成。

2.4 紫鉚花素抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞JAK2激活

A：ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中NO濃度；B：Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)iNOS蛋白表達(dá).n=3.與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS單獨(dú)處理組比較，#P＜0.05.圖2 紫鉚花素抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞NO合成

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中DCFH-DA熒光強(qiáng)度；B：DCF平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì).n=3.與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS單獨(dú)處理組比較，#P＜0.05.圖3 紫鉚花素抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞ROS生成

JAK2是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，可在眾多細(xì)胞因子作用下激活，并通過STAT3啟動下游靶基因。Western blot檢測p-JAK2與JAK2表達(dá)水平的結(jié)果見圖4。LPS刺激下BMDM中JAK2蛋白表達(dá)無明顯變化，但p-JAK2表達(dá)增多，且p-JAK2與JAK2蛋白條帶灰度比值顯著升高(P＜0.05)。研究表明，紫鉚花素是一種酪氨酸激酶抑制劑。我們發(fā)現(xiàn)，與LPS組相比，butein共處理組p-JAK2表達(dá)降低，且p-JAK2/JAK2比值減少，以20μmol/L組最為明顯(P＜0.05)。

A：Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)p-JAK2和JAK2蛋白表達(dá)；B：p-JAK2/JAK2比值的統(tǒng)計(jì)分析.n=3.與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS單獨(dú)處理組比較，#P＜0.05.圖4 紫鉚花素抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞JAK2激活

2.5 紫鉚花素抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞STAT3激活

STAT3是細(xì)胞漿內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞因子刺激下STAT3磷酸化并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄。Western blot檢測內(nèi)p-STAT3和STAT3表達(dá)水平的結(jié)果見圖5。LPS刺激下BMDM中p-STAT3表達(dá)增多，且p-STAT3與STAT3蛋白條帶灰度比值顯著升高(P＜0.05)。與LPS單獨(dú)處理組相比，butein共處理后BMDM內(nèi)p-STAT3表達(dá)降低，且p-STAT3/STAT3比值減少，以20μmol/L組最為明顯(P＜0.05)。

A：Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá)；B：p-STAT3/STAT3比值的統(tǒng)計(jì)分析.n=3.與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS單獨(dú)處理組比較，#P＜0.05.圖5 紫鉚花素抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞STAT3激活

3 討論

炎癥與健康息息相關(guān)，一方面發(fā)揮免疫殺傷作用，可清除病原菌和惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，另一方面通過損傷機(jī)體導(dǎo)致多種急慢性疾病。研究表明，90%以上臨床疾病均存在炎癥細(xì)胞的浸潤和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，例如感染、膿毒血癥、肥胖和腫瘤等[9-10]。巨噬細(xì)胞是體內(nèi)最主要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞，廣泛存在于諸多組織和器官內(nèi)。在脂多糖等致炎因子刺激作用下，巨噬細(xì)胞發(fā)生M1型極化。本研究通過分離小鼠骨髓，并使用GM-CSF誘導(dǎo)分化為BMDM[11]。在500 ng/mL的LPS刺激下，BMDM激活，并釋放一系列炎癥因子，包括TNF-α、IL-6和NO等。同時(shí)氧化應(yīng)激與炎癥關(guān)系密切，巨噬細(xì)胞在炎癥因子刺激下可釋放大量ROS，而ROS可通過NFκB和COX2調(diào)控炎癥反應(yīng)。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)，LPS刺激下BMDM內(nèi)炎性因子和ROS水平顯著升高，結(jié)果表明成功建立了LPS刺激BMDM的體外炎癥模型。

紫鉚花素是一種由中藥中提取的多酚類單體化合物，具有多種生物學(xué)活性[12]。大量研究表明，紫鉚花素具有抗菌、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)和心血管保護(hù)功能[13-14]。而有關(guān)紫鉚花素與炎癥相關(guān)研究較少，本研究中我們使用5、10和20μmol/L紫鉚花素與LPS共同處理BMDM 12 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫鉚花素可抑制LPS誘導(dǎo)的BMDM炎癥反應(yīng)并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，降低培養(yǎng)基中TNF-α、IL-6和NO含量。其中NO既是一種重要炎癥介質(zhì)，又是一種活性較強(qiáng)的ROS，在體內(nèi)具有重要生物學(xué)作用[15]。而NO合成依賴于iNOS，紫鉚花素抑制了iNOS的表達(dá)，進(jìn)而降低了培養(yǎng)基中NO含量。此外，DCFH-DA染色結(jié)果也證實(shí)，紫鉚花素抑制了LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ROS生成。近年來研究表明，炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激既存在交互作用，又存在獨(dú)立作用，因此單純抗炎或者抗氧化往往不足以根除炎癥[16]。因此，我們研究認(rèn)為紫鉚花素兼具抗炎和抗氧化作用，是一種具有研究和開發(fā)價(jià)值的抗炎藥物。

JAK-STAT是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄通路，可以通過與多種細(xì)胞因子和生長因子結(jié)合，參與機(jī)體細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)功能[17]。細(xì)胞因子與JAK受體結(jié)合后形成二聚體，并促進(jìn)JAK的酪氨酸的磷酸化，活化的JAK可與STAT結(jié)合，引起STAT磷酸化以及核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄[18]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，JAK-STAT信號通路與巨噬細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[5]。敲減或抑制JAK2可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6表達(dá)。而JAK2可通過活化STAT3誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞HMGB1和IL-6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使用JAK2-STAT3通路抑制劑，可降低上述促炎因子的表達(dá)[19]。我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激下BMDM中JAK2和STAT3的磷酸化顯著升高，表明該通路激活。紫鉚花素被認(rèn)為是一種酪氨酸激酶抑制劑，而JAK2作為一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，紫鉚花素是否通過JAK2影響STAT3轉(zhuǎn)錄活性目前并不清楚。本研究表明紫鉚花素可顯著阻斷LPS活化BMDM的JAK2和STAT3的磷酸化。因此，我們認(rèn)為紫鉚花素可能是通過JAK2-STAT3信號通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)。

綜上所述，紫鉚花素可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的BMDM活化，降低炎癥因子和ROS生成。作為一種酪氨酸激酶抑制劑，紫鉚花素可能通過抑制JAK2-STAT3發(fā)揮抗炎效應(yīng)。本研究證實(shí)紫鉚花素是一種新的抗炎候選藥物，為炎癥相關(guān)疾病防治提供了新的策略。