朱依青，張彤彤，2，鄭珺文，郝佳潔，蔡 巖，王明榮，梁建偉*，張 鈺，*

(1．國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；2．成都市第三人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究部，四川 成都610031；3．國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，結(jié)直腸外科，北京 100021)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤。在世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率分別位于惡性腫瘤的第3和第4位[1-2]。在我國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤的第5位[3]，而且近年來我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升趨勢。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因[4-6]，然而依據(jù)現(xiàn)有的臨床病理指標(biāo)尚不能準(zhǔn)確預(yù)測結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，因此迫切需要尋找有效的生物標(biāo)志物，對(duì)患者術(shù)后復(fù)發(fā)及死亡風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行更為準(zhǔn)確地鑒別及分層。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian/mechanistic target of rapamycin，mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于PI3K相關(guān)激酶超家族成員。mTOR是兩個(gè)不同的蛋白復(fù)合物，即mTOR復(fù)合物1和2(mTORC1和mTORC2)的催化中心。mTOR復(fù)合物通過磷酸化底物調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞生長、增殖、存活和細(xì)胞骨架組織等[7-9]。有報(bào)道顯示mTOR信號(hào)通路在多種惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)并與患者的預(yù)后不良相關(guān)[10-12]。然而，迄今為止結(jié)直腸癌中mTOR異常活化與患者預(yù)后的關(guān)系尚不明確。

在本研究中，我們采用組織芯片-免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測p-mTOR(Ser2448，活性形式的mTOR)蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，探討pmTOR蛋白表達(dá)改變與結(jié)直腸癌臨床病理指標(biāo)及患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 病例和標(biāo)本

441例結(jié)直腸癌組織以及同一患者手術(shù)切端形態(tài)學(xué)正常的結(jié)直腸組織，取自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院(2007年1月—2011年12月)，均為臨床診斷后剩余的、無壞死的新鮮組織，常規(guī)使用福爾馬林固定和石蠟包埋。所有患者均簽署了知情同意書，該項(xiàng)研究的設(shè)計(jì)和進(jìn)行獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(NCC2016JZ-06)。

以組織病理學(xué)檢查為確診標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)AJCC第八版結(jié)直腸癌分期系統(tǒng)對(duì)確認(rèn)病例進(jìn)行TNM分期?；颊咂骄挲g57.3歲，中位年齡59.0歲(14～91歲)。其中，187名患者(42%)接受了輔助化療和/或放化療，輔助化療采用5-氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療方案。無病生存率和總生存率為主要的研究終點(diǎn)。無病生存率定義為手術(shù)后一段時(shí)間內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移等疾病癥狀和體征的個(gè)體的百分比，總生存率定義為手術(shù)后一段時(shí)間內(nèi)死亡個(gè)體的百分比。隨訪至少5年，97%(429/441)的患者有完整的隨訪信息，其中34%(148/441)的患者在隨訪期間出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。

1.2 組織芯片-免疫組織化學(xué)染色檢測

每個(gè)病例選取3個(gè)典型的癌組織點(diǎn)和2個(gè)相鄰癌旁正常組織點(diǎn)，本室制作結(jié)直腸癌組織微陣列(TMAs)并制備4μm切片[13]。使用PV9000免疫組化試劑盒和DAB染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)進(jìn)行免疫組化檢測，按試劑盒說明進(jìn)行操作。主要步驟如下：切片脫蠟至水化，3%的H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，微波抗原修復(fù)，p-mTOR抗體孵育4℃過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、封片。p-mTOR一抗(Ser2448，#2976)購自CST公司，免疫組化實(shí)驗(yàn)稀釋比為1∶100。將已知p-mTOR高表達(dá)的惡性腫瘤細(xì)胞的組織切片作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

免疫組化反應(yīng)出現(xiàn)棕黃色顆粒判斷為陽性，根據(jù)染色強(qiáng)度和染色面積百分比量化蛋白相對(duì)表達(dá)水平[14-15]。其中，著色程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無染色0分，弱染色1分，中染色2分，強(qiáng)染色3分；染色面積的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：著色范圍≤10%為0分，＞10%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。最終的評(píng)分是兩者得分之積。若兩者得分之積≥3分則為高表達(dá)，＜3分則為低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用配對(duì)t檢驗(yàn)用于評(píng)估結(jié)直腸癌與鄰近正常組織的蛋白表達(dá)差異。采用Pearson卡方檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)分析p-mTOR的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢測分析p-mTOR高表達(dá)與患者無病生存率和總生存率的關(guān)系，使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型確定獨(dú)立預(yù)后因素。

2 結(jié)果

2.1 p-mTOR在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)

使用含有441例結(jié)直腸癌組織和手術(shù)切端形態(tài)學(xué)正常的結(jié)直腸上皮的組織芯片，進(jìn)行p-mTOR蛋白表達(dá)水平的免疫組織化學(xué)檢測，結(jié)果顯示p-mTOR主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)(圖1A)，其在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率為58%(254/441)，而在正常結(jié)直腸上皮中的陽性表達(dá)率僅為4%(17/441)，兩者之間表達(dá)水平差異顯著(P＜0.01，圖1B)。

A：p-mTOR蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果；B：441例結(jié)直腸癌及鄰近正常結(jié)腸上皮中p-mTOR蛋白表達(dá)水平的比較.圖1 免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)直腸癌組織中p-mTOR蛋白的表達(dá)

2.2 p-mTOR表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

我們檢測了結(jié)直腸癌組織中p-mTOR的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M0)的結(jié)直腸癌患者相比，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1/2)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M1/2)的患者組織中p-mTOR的表達(dá)水平更高。同時(shí)，T3/4期患者以及Ⅲ/Ⅳ分期患者的腫瘤組織中p-mTOR的表達(dá)水平高于T1/2期及Ⅰ/Ⅱ期患者(P均＜0.05)，而p-mTOR的表達(dá)水平與患者年齡、性別及組織學(xué)分級(jí)等指標(biāo)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.3 p-mTOR表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

分析p-mTOR高表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后的影響，結(jié)果顯示441例結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年無病生存率和總生存率分別為65%和63%，無病生存時(shí)間和總生存時(shí)間分別為61和63個(gè)月。p-mTOR高表達(dá)患者的無病生存期和總生存期分別為52和60個(gè)月，明顯短于p-mTOR低表達(dá)患者的71和70個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01，圖2)。以上結(jié)果提示，通過檢測p-mTOR的表達(dá)水平，可以預(yù)測結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。

2.4 p-mTOR高表達(dá)是影響結(jié)直腸癌患者無病生存率和總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素

p-mTOR表達(dá)水平和相關(guān)臨床病理特征與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系見表2和表3。單因素分析和Cox多因素回歸分析結(jié)果顯示pT、組織學(xué)分級(jí)及p-mTOR表達(dá)水平是結(jié)直腸癌患者術(shù)后無病生存率和總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素(P均＜0.01)。此外，輔助治療是結(jié)直腸癌患者總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素(P=0.039)。

表1 結(jié)直腸癌組織中p-mTOR蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

A：無病生存率；B：總生存率.根據(jù)結(jié)直腸癌組織中p-mTOR蛋白的免疫組化染色結(jié)果繪制Kaplan-Meier生存曲線，P值為Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果.HR：風(fēng)險(xiǎn)比；CI：置信區(qū)間.圖2 p-mTOR蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者5年無病生存率與總生存率的關(guān)系

表2 結(jié)直腸癌根治術(shù)患者術(shù)后無病生存率與總生存率的單因素Cox回歸分析

表3 結(jié)直腸癌根治術(shù)患者術(shù)后無病生存率與總生存率的多因素Cox回歸分析

3 討論

復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌治療失敗及患者死亡的主要原因。準(zhǔn)確判斷患者術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)可幫助臨床醫(yī)生為患者制定更合理、更有針對(duì)性的隨訪及治療方案，有助于實(shí)現(xiàn)個(gè)體化的精準(zhǔn)治療。因此，尋找、鑒定可準(zhǔn)確識(shí)別高危結(jié)直腸癌患者的生物標(biāo)志物在改善患者預(yù)后及提高其生存率方面具有重要意義及應(yīng)用價(jià)值。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)p-mTOR的表達(dá)水平在58%的結(jié)直腸癌病例中異常升高，其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的無病生存率和總生存率顯著相關(guān)，并且是獨(dú)立的不良預(yù)后因素。與我們的發(fā)現(xiàn)相似，近期有研究報(bào)道p-mTOR在74%的結(jié)直腸癌病例中高表達(dá)，并且是獨(dú)立的不良預(yù)后指標(biāo)[10]。相反，早期的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，p-mTOR的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后無關(guān)[16]。因此，今后可能需要進(jìn)行更多的研究以闡明mTOR異?；罨c結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系。

由于mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)中起著極為重要的作用，它一直被認(rèn)為是一個(gè)非常具有臨床應(yīng)用前景的治療靶點(diǎn)，目前已有多種靶向抑制劑在進(jìn)行惡性腫瘤治療的臨床試驗(yàn)[17-19]。同時(shí)，以往有研究表明，mTOR通路的過度活化可促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[20-23]。我們的免疫染色結(jié)果顯示，在近60%的結(jié)直腸癌病例中存在mTOR的異?；罨⑴c患者較高的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)提示mTOR不僅可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后分層的分子標(biāo)志，同時(shí)也可作為高危患者靶向治療的候選分子靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)mTOR在結(jié)直腸癌組織中異?；罨?，p-mTOR的陽性表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)并且是獨(dú)立的預(yù)后因素，提示mTOR的異?；罨粌H可用于鑒別具有較高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)直腸癌患者，而且可能成為這些高?；颊咧委煹臐撛诜肿影悬c(diǎn)。

(感謝國家癌癥中心/國家腫瘤臨床研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院的趙傳多醫(yī)生在病例隨訪工作中給予的幫助)