趙 驊，陸 雪，蔡恬靜，李 爽，田 梅，劉青杰*

(中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學所，輻射防護與核應急中國疾病預防控制中心重點實驗室，北京 100088)

近年來，核能與電離輻射應用廣泛，核事故和輻射突發(fā)事件也時有發(fā)生。運用快速、高通量的生物分析技術(shù)估算大人群的受照劑量，是制定合理應對措施和指導受照人員臨床治療的關(guān)鍵之處[1-3]。經(jīng)典的細胞遺傳學方法在估算生物劑量時，存在實驗周期長、分析較為復雜等局限性，難以應對大人群受照劑量估算的要求[4-5]，因此探索新的快速、高通量的輻射敏感標志物十分必要。

代謝組學是系統(tǒng)生物學的重要組成部分，是研究生物系統(tǒng)全部代謝物的組成及其動態(tài)變化規(guī)律的學科，通過對內(nèi)源性小分子代謝物(相對分子質(zhì)量＜1 500)進行定性或定量分析，反映機體在健康或疾病狀態(tài)下代謝活動的變化，對于臨床癥狀出現(xiàn)之前的生理狀態(tài)評估具有重要意義，目前代謝組學技術(shù)已在藥理學、毒理學等領(lǐng)域廣泛應用[3，6-7]。本研究采用基于液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)平臺的非靶向代謝組學方法，研究受到60Coγ射線全身照射的大鼠血漿代謝物的變化，篩選輻射敏感代謝物，并初步探索其代謝通路及構(gòu)建劑量-效應曲線，為快速、高通量的輻射損傷生物標志物研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

超快速液相色譜(美國ThermoFisher Scientific公司)；色譜柱UPLC BEH Amide(美國Waters公司)；QExactive四極桿軌道離子阱質(zhì)譜儀(美國ThermoFisher Scientific公司)。

1.2 動物分組與照射條件

SPF級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量200～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SYXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)地點為北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，屏障環(huán)境使用許可證號為SYXK(京)2016-0041。將大鼠隨機均分為對照組和3個照射組，每組5只。將大鼠固定在運輸盒后，在北京市輻射中心用60Coγ射線對其進行全身照射，照射劑量分別為0、1、3、5 Gy，劑量率為1 Gy/min，源強為130 TBq，源靶距為84 cm，平均照射野為50 cm×50 cm。對照組大鼠未受到γ射線照射，其余實驗條件均與照射組相同。本研究通過中國疾控中心輻射安全所實驗動物倫理福利委員會審查(中疾控輻動[2019]001號)。

1.3 血漿樣本制備

大鼠受照射后放回屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)7 d后，通過眼眶內(nèi)眥靜脈采血1～2 mL，置于EDTA抗凝管中，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清，分離的血漿分裝后凍存于-80℃冰箱。

1.4 樣本預處理

血漿樣本在4℃解凍，取100μL加入1.5 mL EP管，加入300μL的乙腈，充分振蕩15 s，進行蛋白沉淀。4℃、12 000 r/min離心10 min，取上層溶液100μL，置于200μL內(nèi)襯管中，待測。

1.5 色譜條件

采用超快速液相色譜對血漿樣本進行分離。流動相A為乙腈、0.1%甲酸、10 mmol/L乙酸銨，流動相B為水、0.1%甲酸、10 mmol/L乙酸銨。柱溫40℃，流速0.3 mL/min，進樣量1.0μL[8]。洗脫程序見表1。

表1 超快速液相色譜洗脫程序

1.6 質(zhì)譜條件

采用四極桿軌道離子阱質(zhì)譜儀對樣本進行超高分辨率一級全掃描，采用正離子模式，電壓為3.7 kV，質(zhì)荷比掃描范圍為50～1 500。采用Xcalibur 2.2 SP1.48軟件進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

用Progenesis QI軟件進行數(shù)據(jù)處理，包括原始數(shù)據(jù)導入、峰對齊、峰提取、歸一化處理，最終形成保留時間、質(zhì)荷比和峰面積的表格。采用SIMCA-P 14.1軟件進行主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，用Progenesis QI及SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，根據(jù)變量權(quán)重(variable importance in projection，VIP)值及P＜0.05為篩選差異代謝物。代謝物鑒定方法采用人類代謝組數(shù)據(jù)庫(human metabolome database，HMDB)進行一級分子量匹配，比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比或者精確分子質(zhì)量，誤差限制0.01 Da。用MetaboAnalyst 4.0及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫進行通路分析。不同組間代謝物相對含量采用t檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)量控制

將所有大鼠血漿樣本用移液器吸取10μL混合均勻后得到質(zhì)量控制樣本(quality control，QC)，其前處理方法與實測樣本相同。應用PCA對QC樣本和實測樣本進行分析。QC樣本是相同的成分，在PCA得分圖中相對聚集，表明系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，數(shù)據(jù)可靠(圖1A)。大鼠血漿經(jīng)LC-MS分析后，共檢測到3 815個特征離子峰，發(fā)現(xiàn)的代謝物主要包括氨基酸類和肉堿類等幾類物質(zhì)。

2.2 主成分分析及正交偏最小二乘方判別分析

為觀察大鼠受到γ射線照射后代謝物總體的變化，將所有組大鼠血漿進行PCA分析(圖1B)。在得分圖上彼此之間距離越遠，表示差異越大。結(jié)果表明，經(jīng)射線照射后的大鼠血漿代謝譜發(fā)生了明顯的變化，模型的解釋率(R2X)為0.501，模型的預測率(Q2)為0.221，5 Gyγ射線照射組與對照組能夠明顯區(qū)分，而1 Gy、3 Gyγ射線照射組和對照組有一定的重疊。為獲得導致這種差異的代謝物信息，將對照組與5 Gyγ射線照射組進一步采用監(jiān)督性的多維統(tǒng)計方法即正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)，5 Gyγ射線照射組與對照組能夠明顯區(qū)分，其模型的解釋率(R2Y)為0.998，模型的預測率(Q2)為0.933(圖2A)。為驗證模型的有效性，對該模型重復進行200次置換驗證，圖2B中左側(cè)兩列的隨機實驗數(shù)值均低于右上方的原始值，表明該模型未出現(xiàn)過擬合，具有良好的預測性和穩(wěn)定性。

A：質(zhì)控樣本與實測樣本；B：0、1、3、5 Gyγ射線照射組大鼠血漿樣本.圖1 主成分分析得分圖

A：5 Gyγ射線照射組與對照組大鼠血漿樣本正交偏最小二乘方判別分析；B：置換檢驗模型驗證.左側(cè)兩列為重復進行200次置換檢驗的R2和Q2，右上方兩個點為最終得到最優(yōu)模型的R2和Q2.左側(cè)兩列的隨機實驗數(shù)值的R2低于最優(yōu)模型的R2，Q2截距小于0，表明該模型未出現(xiàn)過擬合.圖2 大鼠血漿樣本正交偏最小二乘方判別分析及模型驗證

2.3 輻射敏感代謝物的篩選

為篩選輻射敏感代謝物，將5 Gyγ射線照射組與對照組大鼠代謝物進行比較，結(jié)合P＜0.05、VIP＞1，共篩選出11個潛在的差異代謝物(表2)，其中，丁?；鈮A相對含量明顯上調(diào)；十八二烯酰基肉堿、2-甲基煙酰胺、十八一烯?；鈮A、十六?；鈮A、?；撬帷燉０?、咪唑乙酸、己?；鈮A、L-犬尿氨酸、胞嘧啶相對含量明顯下調(diào)。本研究分析了11個差異代謝物在各組的相對含量(表3)，并根據(jù)差異代謝物的相對含量進行熱圖分析，用顏色的深淺代表含量的高低，紅色表示含量高，藍色表示含量低(圖3)。與對照組相比，十八二烯?；鈮A、十八一烯?；鈮A、十六?；鈮A、己酰基肉堿、胞嘧啶在1、3、5 Gyγ射線照射組均顯著下調(diào)(P＜0.05)。此外，還分析了差異代謝物含量隨照射劑量的變化，十八二烯?；鈮A、十八一烯?；鈮A、十六?；鈮A、牛磺酸、L-犬尿氨酸、胞嘧啶的相對含量隨照射劑量的上升而下降，符合線性方程模型(表4)。

2.4 代謝通路分析

為研究大鼠輻射損傷生物標志物所涉及的代謝途徑和代謝物之間的關(guān)聯(lián)性，對11個具有顯著性差異的代謝物進行通路富集分析。將所有差異代謝物進行整合，尋找其關(guān)聯(lián)性并篩選出和輻射損傷最相關(guān)的代謝途徑(圖4)。結(jié)果顯示，大鼠受到γ射線全身照射后，損傷主要涉及?；撬岷蛠喤；撬岽x、煙酸和煙酰胺代謝、初級膽汁酸生物合成等代謝通路。

表2 5 Gy 60Coγ射線照射后的大鼠血漿差異代謝物

表3 0～5 Gy 60Coγ射線照射后大鼠血漿差異代謝物的相對含量

圖3 大鼠受照后血漿差異代謝物熱圖分析

表4 大鼠血漿輻射敏感差異代謝物的劑量-效應曲線

3 討論

A：?；撬岷痛闻；撬岽x；B：煙酸和煙酰胺代謝；C：初級膽汁酸生物合成；D：色氨酸代謝；E：脂肪酸代謝.橫坐標表示代謝通路的重要性，縱坐標表示代謝通路富集分析的顯著性水平，代謝通路越靠近右上方表示可信性越高.圖4 大鼠受到60Coγ射線全身照射后差異代謝物通路富集分析結(jié)果

輻射可直接或間接對機體組織和細胞造成損傷，影響機體正常代謝活動，導致基因突變，進而引發(fā)一系列氧化應激反應并導致機體代謝功能紊亂，過往已有研究利用代謝組學技術(shù)篩選生物標志物，然而代謝物的變化在不用物種、不同樣本間差異較大[9-13]。為篩選輻射損傷代謝物，本研究以全身照射的大鼠為模型，利用基于LC-MS的代謝組學方法，發(fā)現(xiàn)大鼠受照后血漿中11個代謝物發(fā)生了顯著變化，其中十八二烯?；鈮A、十八一烯?；鈮A、十六?；鈮A、?；撬帷-犬尿氨酸、胞嘧啶的相對含量隨照射劑量的上升而下降，在0～5 Gy范圍內(nèi)，具有良好的劑量-效應關(guān)系(R2＞0.85)，這是成為輻射生物劑量計的基本條件。

在輻射損傷所涉及的代謝通路中，牛磺酸在?；撬岽x通路及初級膽汁酸生物合成過程中發(fā)揮重要作用，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、脂質(zhì)代謝和免疫功能以及維持細胞滲透壓等都具有顯著性影響，在肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等都具有極其重要的生理作用[14-15]。與對照組相比，照射組?；撬岷匡@著性降低，提示電離輻射可能導致?；撬岽x紊亂，其病理原因可能是由于細胞滲透壓失調(diào)，減少能量供給，從而產(chǎn)生生理功能障礙。

煙酸和煙酰胺是脂質(zhì)代謝反應體系輔酶的重要組成部分，煙酸是人體必需的維生素之一，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺，煙酰胺是輔酶I和輔酶Ⅱ的組成部分，參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝及糖類無氧分解等過程[16-17]。與對照組相比，照射組煙酰胺及2-甲基煙酰胺含量顯著性降低，可能與其脂質(zhì)代謝異常有關(guān)。

犬尿氨酸通路是色氨酸代謝的主要途徑，也是神經(jīng)退行性疾病及嚴重腦損傷中神經(jīng)元損傷的重要途徑。犬尿氨酸及其代謝產(chǎn)物的累積，在調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要功能，包括神經(jīng)活性及神經(jīng)毒性等[18]。本研究結(jié)果表明，照射組大鼠色氨酸代謝通路中的L-犬尿氨酸含量顯著變化，提示5 Gy60Coγ射線可能導致色氨酸代謝紊亂，進而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷。

綜上所述，采用代謝組學方法可篩選出一系列潛在的輻射敏感標志物，其樣本容易獲得，并具有高通量等特點，是輻射生物劑量計研究的優(yōu)勢條件[3，19-20]。本研究以受到全身照射的大鼠作為損傷模型，發(fā)現(xiàn)電離輻射可導致大鼠血漿中代謝物發(fā)生顯著性變化，篩選出血漿中11個差異代謝物可作為潛在的輻射敏感標志物，損傷主要涉及?；撬岷蛠喤；撬岽x、煙酸和煙酰胺代謝、初級膽汁酸生物合成等代謝通路。本研究為輻射損傷生物標志物提供了科學依據(jù)，下一步還將對已篩選出的差異代謝物進行定量分析。