郭繼倩,孫亦釗,付書娟,張思嘉,代俊俊,尹震花,陳 林

黃河科技學(xué)院 鄭州市天然產(chǎn)物合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州450063

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifolia L的干燥成熟果實(shí),為傳統(tǒng)中藥[1]。按照《衛(wèi)生部關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》(衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕51號(hào))中執(zhí)行,補(bǔ)骨脂為可用于保健食品的物品。現(xiàn)代研究表明,補(bǔ)骨脂含有香豆素類、黃酮類、單萜類等多種成分,顯示出具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等多種功效[2-3]。關(guān)于補(bǔ)骨脂多糖的研究,目前僅國(guó)內(nèi)幾位學(xué)者對(duì)補(bǔ)骨脂不同產(chǎn)地多糖的含量及粗多糖的免疫活性進(jìn)行了初步研究[4-7]。本課題組對(duì)補(bǔ)骨脂粗多糖的分離純化、抗腫瘤活性及對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力進(jìn)行了研究[8-9],但超聲波輔助提取補(bǔ)骨脂多糖工藝及抗氧化活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

超聲波提取可以提高被提取成分從固體中的溶出速率,提高提取效率。如能將補(bǔ)骨脂充分利用,快速、高效的生產(chǎn)出補(bǔ)骨脂多糖,對(duì)增加補(bǔ)骨脂的附加值具有積極的意義。因此,本研究采用超聲波輔助從補(bǔ)骨脂中提取多糖,在單因素基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,進(jìn)一步研究其抗氧化活性,為補(bǔ)骨脂的深加工和副產(chǎn)物(有機(jī)溶劑提取后殘?jiān)?的充分利用提供理論依據(jù)。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

補(bǔ)骨脂(批號(hào)：170703),2018年9月購(gòu)于河南省張仲景大藥房,產(chǎn)地河南,經(jīng)河南大學(xué)中藥研究所李昌勤教授鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifolia L的干燥成熟果實(shí),標(biāo)本存于黃河科技學(xué)院天然藥物研究室；石油醚、無(wú)水乙醇,天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；濃硫酸,開(kāi)封方晶化工；苯酚,天津凱通化學(xué)試劑；ABTS,上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；DPPH,梯希愛(ài)上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；超純水,實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器

HK-10B 500g搖擺式粉碎機(jī)(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)；KQ-500DE數(shù)據(jù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；En Vision多標(biāo)記微孔板檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Per Kin Elmer公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂多糖提取工藝優(yōu)化

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.050 0 g,加適量蒸餾水溶解于50 m L容量瓶中,加蒸餾水至刻度線搖勻,制得質(zhì)量濃度為1 mg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 m L,分別置于50 m L容量瓶中,定容稀釋,搖勻,備用。取不同質(zhì)量濃度的稀釋液各200μL于離心管中,加入200μL苯酚溶液搖勻,而后加入1 000μL濃硫酸,搖勻,在室溫下靜置30 min。冷卻后,以蒸餾水代替葡萄糖做空白對(duì)照,用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線,計(jì)算出線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)：

式中,X為葡萄糖的質(zhì)量濃度,Y為吸光度。結(jié)果表明,葡萄糖質(zhì)量濃度在0.01～0.12 mg/m L范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.1.2 補(bǔ)骨脂總多糖含量測(cè)定

補(bǔ)骨脂粉碎后用適量的石油醚脫脂3次,每次3d；殘?jiān)鼡]發(fā)干石油醚,用適量的乙醇(體積分?jǐn)?shù)70%)室溫浸提4次,每次2 d；補(bǔ)骨脂殘?jiān)匀魂幐?儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取1.000 g預(yù)處理后的補(bǔ)骨脂殘?jiān)?超純水作為溶劑,以一定液料比,在一定超聲功率、超聲時(shí)間及溫度下提取多糖,提取2次,趁熱減壓抽濾,合并濾液；濾液與Sevage試劑混合,磁力攪拌30min后離心(4 000r/min,8min),取上清液,即得到脫蛋白的粗多糖溶液。準(zhǔn)確定容實(shí)驗(yàn)所得粗多糖溶液至150 m L容量瓶中,超純水定容；準(zhǔn)確移取溶液200μL,依據(jù)苯酚-硫酸法測(cè)得吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線算出粗多糖的百分含量,再由式(1)算出多糖的得率,平行3次,取平均值。

式中：C為粗多糖溶液的濃度,mg/mL；V=150 mL為多糖定容的體積；N為稀釋倍數(shù)；M為預(yù)處理后補(bǔ)骨脂的質(zhì)量,g。

2.1.3 補(bǔ)骨脂多糖提取單因素試驗(yàn)

結(jié)合文獻(xiàn)[10-13]查證,考查超聲時(shí)間、料液比、溫度和超聲波功率對(duì)補(bǔ)骨脂多糖提取的影響。

1)料液比。固定超聲波功率為400 W,超聲時(shí)間為30 min,溫度為70℃,考察不同料液比(20 m L∶1 g、30 m L∶1 g、40 m L∶1 g、50 m L∶1 g和60 m L∶1 g)對(duì)補(bǔ)骨脂多糖得率的影響。結(jié)果(圖1)顯示,液料比對(duì)補(bǔ)骨脂多糖得率有一定影響。隨著料液比增加,多糖得率先增大后下降；當(dāng)料液比30 m L∶1 g時(shí),多糖得率達(dá)到最高,為2.19%；當(dāng)液料比大于30 m L∶1 g時(shí),多糖得率逐漸下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)提取溶劑增加時(shí),對(duì)于一定量的補(bǔ)骨脂殘?jiān)勰┡c水的接觸面積增加,有利于多糖溶出。當(dāng)水量過(guò)多時(shí),水會(huì)吸收超聲波的輻射,從而使細(xì)胞破壁作用降低,多糖得率趨于緩慢。料液比選擇30 m L∶1 g為宜,選擇料液比20 m L∶1 g、30 m L∶1 g和40 m L∶1 g三個(gè)水平做正交實(shí)驗(yàn)。

圖1 料液比對(duì)多糖得率的影響

2)超聲波功率。固定料液比為30 m L∶1 g,超聲時(shí)間為30 min,溫度為70℃,考查不同超聲波功率(200、250、300、350、400 W)對(duì)補(bǔ)骨脂多糖得率的影響。結(jié)果(圖2)顯示,超聲波功率對(duì)補(bǔ)骨脂多糖得率有一定影響。隨著超聲波功率的增強(qiáng),補(bǔ)骨脂多糖得率逐漸增加；當(dāng)超聲波功率增加到350 W,多糖得率達(dá)到最高,為2.36%；繼續(xù)增強(qiáng)功率,多糖得率逐漸下降。這可能由于在其他條件不變的情況下,超聲波功率越高,超聲波在水介質(zhì)中產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械波動(dòng)效應(yīng)對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用就越大,多糖就越容易溶解析出,然而當(dāng)超聲波功率過(guò)高時(shí),可能會(huì)使多糖降解,得率下降。故超聲波功率比選擇為350 W左右為宜,選擇超聲波功率250、300、350 W三個(gè)水平做正交實(shí)驗(yàn)。

圖2 超聲功率對(duì)多糖得率的影響

3)超聲時(shí)間。固定料液比為30 m L∶1 g,超聲波功率為350 W,溫度為70℃,考查不同超聲時(shí)間(20、25、30、35、40 min)對(duì)補(bǔ)骨脂多糖得率的影響。結(jié)果(圖3)顯示,超聲時(shí)間對(duì)補(bǔ)骨脂多糖得率有一定影響。當(dāng)超聲時(shí)間低于30 min時(shí),補(bǔ)骨脂多糖得率隨超聲時(shí)間的增加先下降后增加；超聲時(shí)間為30 min時(shí),多糖得率達(dá)到最大,為1.89%；繼續(xù)增加超聲時(shí)間,多糖得率下降。這說(shuō)明了多糖提取過(guò)程與超聲波處理時(shí)間密切相關(guān),超聲波提取時(shí)間短,多糖不能充分溶出；處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能使多糖結(jié)構(gòu)破壞,得率也下降。因此,超聲時(shí)間選擇30 min為宜。選擇超聲時(shí)間30、35、40 min三個(gè)水平做正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

4)溫度。固定料液比為30 m L∶1 g,超聲波功率為350 W,超聲時(shí)間為30 min,考查不同提取溫度(40、50、60、70、80℃)對(duì)補(bǔ)骨脂多糖得率的影響。結(jié)果(圖4)顯示,溫度對(duì)補(bǔ)骨脂多糖得率有一定影響。多糖得率隨著提取溫度的增加而逐漸增加；當(dāng)溫度為80℃時(shí),多糖得率達(dá)到最大,為2.09%；溫度越高,多糖溶解析出越充分,但是溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致多糖的部分降解,導(dǎo)致多糖得率下降?？紤]到儀器的承受能力以及客觀的現(xiàn)實(shí)耗能情況等,溫度選擇80℃為宜,選擇溫度60、70、80℃三個(gè)水平做正交實(shí)驗(yàn)。

圖4 溫度對(duì)多糖得率的影響

2.1.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用SPSS 19.0軟件,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置水平,以超聲時(shí)間、料液比、溫度、超聲波功率4個(gè)因素的3個(gè)水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L9(34)優(yōu)化超聲波輔助提取補(bǔ)骨脂多糖的工藝。因素水平表見(jiàn)表1,正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3。

從表2的極差分析可知,影響補(bǔ)骨脂多糖得率的因素主次順序?yàn)榱弦罕?B)、溫度(C)、超聲時(shí)間(A)、超聲波功率(D),最優(yōu)的參數(shù)組合為A2B1C3D3,即超聲時(shí)間為35 min,料液比為20 m L∶1 g,溫度為80℃,超聲波功率為350 W。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

由表3方差分析可知,在超聲波輔助提取補(bǔ)骨脂多糖工藝正交實(shí)驗(yàn)所選擇的因素和水平范圍內(nèi),料液比和溫度對(duì)補(bǔ)骨脂多糖的得率有極顯著影響(P＜0.001),超聲時(shí)間對(duì)多糖的得率有非常顯著影響(P＜0.01),而超聲波功率對(duì)多糖的得率影響不大(P＞0.05),方差分析結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致。

2.1.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,以超聲時(shí)間為35 min、料液比為20 m L∶1g、溫度為80℃、超聲波功率為350W的參數(shù)進(jìn)行提取,得率均值為2.35%(n=6),說(shuō)明優(yōu)化后的提取工藝參數(shù),使多糖得率顯著提高。

2.2 抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]方法,測(cè)定補(bǔ)骨脂多糖對(duì)清除DPPH自由基的清除率,按公式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。每份樣品平行操作3次,取平均值。

式中,Acontrol為DPPH本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收度,Asample為樣品對(duì)DPPH作用后的吸收度數(shù)值(除去樣品自身吸收)。

補(bǔ)骨脂多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力見(jiàn)表4。結(jié)果顯示,在初始濃度下,補(bǔ)骨脂多糖對(duì)DPPH自由基的清除率為13.26%,低于50%,未進(jìn)一步的研究。

表4 補(bǔ)骨脂多糖對(duì)DPPH和ABTS自由基清除活性

2.2.2 清除ABTS自由基能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15]方法,測(cè)定補(bǔ)骨脂多糖對(duì)清除ABTS自由基的清除率,按公式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率。每份樣品平行操作3次,取平均值。

式中,Acontrol為ABTS自由基本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收度,Asample為樣品對(duì)ABTS自由基作用后的吸收度數(shù)值(除去樣品自身吸收)。

補(bǔ)骨脂多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力見(jiàn)表4?？梢钥闯?在初始濃度下,補(bǔ)骨脂多糖對(duì)ABTS自由基的清除率為52.92%,對(duì)ABTS自由基的清除率大于50%。為了進(jìn)一步研究濃度與清除率的關(guān)系,對(duì)多糖進(jìn)一步稀釋,測(cè)定半數(shù)抑制率。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),補(bǔ)骨脂多糖對(duì)ABTS自由基清除率與濃度呈正量效關(guān)系(圖5),多糖濃度(X)與清除率(Y)的回歸線性方程和相關(guān)系數(shù)為：

圖5 補(bǔ)骨脂多糖質(zhì)量濃度與ABTS自由基清除率關(guān)系

表明,隨著濃度增加,其對(duì)ABTS自由基清除率也隨之增大(IC50=88.39μg/m L)。

3 討論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了超聲波輔助提取補(bǔ)骨脂多糖工藝條件。確定了最佳提取工藝：超聲時(shí)間為35 min,料液比為20 m L∶1 g,溫度為80℃,超聲波功率為350 W。在優(yōu)化工藝下,補(bǔ)骨脂多糖的得率為2.35%。孫玲[4]采用90℃水提醇沉法提取產(chǎn)于不同產(chǎn)地的補(bǔ)骨脂中的多糖,結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地的補(bǔ)骨脂中多糖的含量在0.41%～1.26%,其中以安徽、河南(魯山縣)兩個(gè)產(chǎn)地的補(bǔ)骨脂中多糖含量最高,達(dá)到了1.26%和1.13%；李發(fā)勝等[7]等采用沸水提醇沉法提取購(gòu)買于大連國(guó)藥大藥房的補(bǔ)骨脂中的多糖,結(jié)果顯示,多糖的含量達(dá)到3.84%。本文采用超聲波輔助提取產(chǎn)于安徽的補(bǔ)骨脂多糖,多糖的得率達(dá)到了2.35%?？梢?jiàn),補(bǔ)骨脂多糖的含量具有地域性差異引起,而且與水浸提法相比,采用超聲波輔助提取補(bǔ)骨脂中的多糖可明顯的縮短提取時(shí)間,提高提取效率。

補(bǔ)骨脂多糖對(duì)ABTS自由基具有較強(qiáng)的清除能力,對(duì)DPPH自由基的清除能力較弱?？赡苁且?yàn)檠a(bǔ)骨脂多糖不能提供一個(gè)電子使其與DPPH的單電子配對(duì)[16]。另外,多糖的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān),如糖鏈結(jié)構(gòu)、分子量大小、單糖組成等[17],對(duì)補(bǔ)骨脂多糖進(jìn)行分離純化及構(gòu)效探討將有助于促進(jìn)補(bǔ)骨脂的開(kāi)發(fā)利用。本研究為補(bǔ)骨脂多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了重要依據(jù)。