吳 敏，何青蘭，李虹秀，李品英，黃正迎，楊 婷，毛 惠

（1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；3.樂山市中醫(yī)醫(yī)院，四川 樂山 614000）

全世界每年大約有8500萬例非意愿妊娠，其中50%以流產(chǎn)告終[1]。近年來，由于米非司酮聯(lián)聯(lián)合索前列醇終止早孕具有成功率高、使用方便、經(jīng)濟的特點而成為藥物流產(chǎn)的常用方法。但藥流后常有藥流不完全而導(dǎo)致陰道流血時間長和陰道流血量多的并發(fā)癥。我院院內(nèi)制劑益母縮宮顆粒由《傅青主女科》生化湯化裁而來，由益母草、川芎、枳殼、當(dāng)歸、炮姜、桃仁、生蒲黃組成，具有活血化瘀、促進宮縮的作用，前期研究證實其能有效減少藥物流產(chǎn)后陰道流血時間，有促進惡露排出及輔助子宮復(fù)舊的作用[2][3]，但其對藥物流產(chǎn)后子宮的作用機制尚未完全明確，本實驗按照王曉東[4]所述實驗方法造成藥物不全流產(chǎn)大鼠模型，檢測大鼠子宮勻漿中NO含量及NOS活力尋找本藥對于模型大鼠子宮可能的作用機制，為該藥的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，也為本藥的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級別SD大鼠，雌性60只，雄性30只，由成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號 SCXK（川）2015-030。雌性大鼠體重210～240 g，雄性大鼠體重250～280 g，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號SYXK（川）2018-065。

1.2 實驗藥物

益母縮宮顆粒，10 g/袋，西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，批號20181005，大鼠給藥量為低劑量組3.125 g/（kg.d），中劑量組6.25 g/（kg.d），高劑量組12.5 g/（kg.d）。

新生化顆粒，9 g/袋，江蘇仁壽藥業(yè)有限公司，批號181211，大鼠服藥劑量為2.813 g/（kg.d）。

米非司酮，內(nèi)含米非司酮25 mg/片，華潤紫竹藥業(yè)有限公司，批號431904011，大鼠給藥量為8.3 mg/kg。

米索前列醇，內(nèi)含米索前列醇0.2 mg/片，華潤紫竹藥業(yè)有限公司，批號43190302，大鼠灌胃量為0.1 mg/kg。

水合氯醛，100 g/瓶，天津大茂化學(xué)試劑廠，批號20181201，使用時用生理鹽水配制成10% 溶液。

所有灌胃藥物均根據(jù)人鼠劑量比換算成大鼠灌胃劑量，成人體重按60 kg計算。

1.3 實驗所需試劑及儀器

實驗試劑：總蛋白（TP）測試盒，A045-2-1；一氧化氮（NO）測試盒，A012-1-2；總一氧化氮合成酶（NOS）測試盒，A014-2-2，均由南京建成生物工程研究所提供。

實驗儀器：恒溫電子水浴鍋，型號DZKW-4，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；酶標儀，型號SpectraMAX Plus384，美谷分子儀器有限公司；722可見分光光度計，UV752N紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，型號UPH-Ⅱ-10T，成都超純科技有限公司；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，型號SYQ-DSX-280B，上海申安醫(yī)療器械廠。

2 實驗方法

2.1 造模

按照王曉東[4]所述實驗方法造模，將雌雄大鼠于每日下午18：00按2：1合籠，次晨08：00檢查雌鼠陰道，查見陰栓或者陰道分泌物涂片于鏡下查見精子則視為該雌鼠受孕d1，未受孕雌鼠于下午18：00繼續(xù)合籠，連續(xù)合籠一周。

將受孕雌鼠取8只作為空白組分籠喂養(yǎng)，其余受孕雌鼠受孕d7統(tǒng)一造模，受孕d7日晨08：00灌胃米非司酮混懸液0.83 mg/ml，下午18：00灌胃米索前列醇混懸液0.01 mg/ml，空白組大鼠灌胃動物實驗中心飲用水，灌胃濃度均為1 ml/100g。灌胃米索前列醇后于雌鼠陰道內(nèi)置入定量棉球1枚，次晨檢查大鼠陰道內(nèi)棉球，查見血跡認定為造模成功。將造模成功大鼠分為益母縮宮顆粒高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組及新生化顆粒組。

各組大鼠均于受孕d8灌胃藥物，實驗組分別灌胃高、中、低濃度益母縮宮顆粒，對照組灌胃新生化顆粒，模型組及空白組大鼠灌服動物實驗中心飲用水。連續(xù)灌胃7天，每天1次。

2.2 動物標本的采集

各組大鼠于開始灌胃第8天用水合氯醛按0.35 ml/100 g劑量腹腔注射麻醉大鼠，麻妥后將大鼠固定于臺上，腹部正中行縱切口，逐層開腹，鈍性分離周圍組織，找到子宮，用眼科剪分離子宮，下自宮頸口，上自子宮末端，離斷子宮，置于天平上進行稱重，稱重后將子宮組織置于-80℃冰箱里保存以備制備組織勻漿。

2.3 子宮勻漿中NO含量及NOS活力的檢測方法

取出子宮組織，梯度溫度解凍，稱取組織塊0.1 g～0.2 g在冰生理鹽水中漂洗除去多余血液及雜質(zhì)，用濾紙拭干組織，稱重，然后放入5 mL的EP管內(nèi)。量取0.9%生理鹽水，按組織質(zhì)量與生理鹽水體積m：v比為1：9的比例加入生理鹽水，然后剪碎組織，用勻漿機研磨，制成10%組織勻漿。將制備好的組織勻漿用離心機以3500 r/min轉(zhuǎn)速離心10分鐘，然后留取上清液以備檢測。按硝酸酶還原法檢測上清液中NO含量及NOS活力，按照指示盒說明進行操作。

2.4 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)資料用SPSS 23.0進行分析，所有資料均為計量資料，數(shù)據(jù)分布呈正態(tài)分布且方差齊，用“±s”表示，統(tǒng)計方法使用用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較用LSD-t法進行分析。P＜0.05則認為差異具備統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

表1 益母縮宮顆粒對藥物不全流產(chǎn)大鼠子宮勻漿NO含量及NOS活力的影響（±s）

表1 益母縮宮顆粒對藥物不全流產(chǎn)大鼠子宮勻漿NO含量及NOS活力的影響（±s）

備注：與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與新生化顆粒組相比，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

組別 N/只 NO含量（MMOL/GPROT） NOS活力（U/MGPROT）模型組 8 12.698±2.463▲ 1.210±0.142新生化顆粒組 9 9.781±2.786# 1.116±0.177低劑量組 8 13.227±2.271▲▲ 1.231±0.182中劑量組 9 10.956±2.899 1.285±0.234▲高劑量組 9 9.961±2.076# 1.057±0.117

與模型組相比，益母縮宮顆粒高劑量組及新生化顆粒組子宮勻漿中NO含量降低，差異顯著（P＜0.05），益母縮宮顆粒中劑量組子宮勻漿中NO含量有降低趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與新生化顆粒組相比，益母縮宮顆粒低劑量組子宮勻漿中NO含量有所升高，差異顯著（P＜0.01），余組間未見統(tǒng)計學(xué)差異。

與模型組相比，益母縮宮顆粒高劑量組和新生化顆粒組NOS活力有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與新生化顆粒組相比，益母縮宮顆粒中劑量組NOS活力升高，差異顯著（P＜0.05）。

證實新生化顆粒和高劑量益母縮宮顆粒均能減少模型大鼠子宮勻漿中NO含量，對NOS活力無顯著影響，且益母縮宮顆粒對模型大鼠NO含量呈一定的劑量依賴效應(yīng)。

4 討 論

NO是一類能使平滑肌組織及血管舒張的氣體分子，NO生成后能立即擴散到周圍的平滑肌細胞中，與sGC結(jié)合并激活sGC，在Mg2+的作用下升高平滑肌細胞的cGMP水平，使細胞內(nèi)Ca2+濃度下降，從而導(dǎo)致平滑肌松弛、血管擴張[5]。NOS是合成NO必須的物質(zhì)，同時也是NO合成的限速因子[6]。NO對也子宮平滑肌的舒張起重要作用，NO含量降低，可通過促進子宮平滑肌收縮，起到止血的作用[7]。本實驗證實高劑量益母縮宮顆?？山档湍Ｐ痛笫笞訉m勻漿中NO含量，可能通過此途徑對模型大鼠子宮平滑肌起到收縮的作用。

分析各藥物的作用，方中益母草、蒲黃、桃仁、枳殼對于子宮平滑肌均表現(xiàn)出正性肌力作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，益母草的生物堿和酚酸類化合物有增強大鼠子宮平滑肌收縮的作用[8]，當(dāng)歸具有抑制和促進子宮收縮兩種作用[9]；川芎提取液可抑制離體子宮平滑肌的收縮[10]；蒲黃對離體子宮及在體子宮均表現(xiàn)為促進子宮平滑肌興奮作用[11]；桃仁醇提取物能增強豚鼠子宮的收縮作用；枳殼對家兔子宮表現(xiàn)為興奮作用，使子宮收縮力及緊張度增加。它們共同作用于子宮平滑肌組織，起到促進模型大鼠子宮收縮的作用。

前期研究證實[3]，益母縮宮顆粒能有效減少藥物不全流產(chǎn)大鼠陰道出血時間及出血量。本實驗進一步證實，益母縮宮顆?？赏ㄟ^減少模型大鼠子宮勻漿中NO含量，起到促進子宮收縮的作用，可能通過此途徑起到減少模型大鼠的陰道出血時間及出血量的作用。但益母縮宮顆粒對藥物不全流產(chǎn)大鼠的作用機制仍需進行進一步深入探索。