呂東輝，韓 笑，苑廣信，劉 玲，安麗萍，杜培革

(北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

中國是世界上具有悠久歷史的養(yǎng)鹿大國，梅花鹿全身都是寶［1］，是經(jīng)濟價值相當(dāng)高的動物.鹿茸含有大量的鈣、磷、生長因子、多糖、多肽及蛋白質(zhì)等多種化合物.其中蛋白質(zhì)類物質(zhì)含量過半，鹿茸多肽(VAP)作為潛在的生物活性資源受到關(guān)注.梅花鹿茸具有溫補肝腎、強筋健骨等功效.

骨質(zhì)疏松癥是一種全身代謝性的骨骼疾病，以骨組織單位體積骨量的降低和骨組織顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性改變?yōu)樘卣鳎?dǎo)致骨骼的脆性增加和骨折危險性增高，被稱為“無聲無息的流行病”.骨骼是一種動態(tài)活性組織，其結(jié)構(gòu)的完整和礦化平衡需要其持續(xù)重塑來實現(xiàn)［1］.在這一過程中，成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的活性協(xié)調(diào)一致，達(dá)到骨重塑過程的動態(tài)耦聯(lián)平衡，發(fā)揮骨形成功能的成骨細(xì)胞和發(fā)揮骨吸收功能的破骨細(xì)胞在骨骼重塑中發(fā)揮重要作用［2-4］.骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制是破骨細(xì)胞的骨吸收大于成骨細(xì)胞的骨形成，導(dǎo)致骨重建負(fù)平衡［5］.可見，成骨細(xì)胞的大量增殖、分化對治療骨質(zhì)疏松癥具有關(guān)鍵的促進(jìn)作用.

小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1屬于前成骨細(xì)胞［6］，它具有成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的所有特性，可以表達(dá)以及分泌骨細(xì)胞所具有的多種蛋白和受體，在研究藥物對骨作用的影響中，MC3T3-E1細(xì)胞是最為常用的骨代謝細(xì)胞模型.鹿茸中含有一些活性物質(zhì)，其能夠促進(jìn)骨細(xì)胞增殖，加速骨折的愈合，治療骨質(zhì)疏松［7］.

1 材料與方法

1.1 材 料

新鮮二杠梅花鹿鹿茸(吉林省吉林市龍?zhí)渡较蜿柭箞?;冰醋酸溶液(遼寧泉瑞試劑有限公司);裂解液(碧云天);AR2140型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);FSH-2型可調(diào)高速組織勻漿機(江蘇金壇億通電子有限公司);AS系列超聲波清洗機(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);AG-5805臺式離心機(上海志江商貿(mào)有限公司);YC-2層析實驗冷柜(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);HJ-6多頭磁力加熱攪拌器(蘇州威爾實驗用品有限公司);4℃冷藏冰箱(青島海爾集團公司);SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);HH S1-Ni電熱恒溫水浴鍋(北京長安科學(xué)儀器廠);超凈工作臺;二氧化碳培養(yǎng)箱(SHELL/JB);倒置顯微鏡(XDS-1B);熒光顯微鏡(IBE2000);移液器、96孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、分析天平(FA1004，HENGPING);pH計(北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司);HH S1-Ni電熱恒溫水浴鍋(武漢愛斯佩科學(xué)儀器有限公司);SHZ-80A水浴恒溫振蕩器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);酶標(biāo)儀(infinite M200 ThernoMixer).

1.2 方 法

1.2.1 勻漿法提取梅花鹿茸多肽

稱取新鮮的梅花鹿茸約100 g，微解凍后，用切片機切成薄片，用粉碎機粉碎后放入到燒杯中，用預(yù)先放于層析柜(4℃)中冷卻過的蒸餾水沖洗數(shù)次，至完全無血色;加入預(yù)冷的勻漿液(pH3.5的冰醋酸溶液)500 mL，勻漿機高速勻漿10 min(勻漿1 min后停30 s)，使其充分散熱，始終將勻漿瓶放入冰浴中，低溫保持提取物活性，于4℃、以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上清液，標(biāo)號后4℃保存待測.

1.2.2 勻漿裂解法提取梅花鹿茸多肽

實驗步驟同1.2.1，勻漿后加入裂解液，在冰上不斷搖晃，裂解0.5 h，于4℃、以10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 m in，吸取上清液，標(biāo)號后，4℃保存待測.

1.2.3 勻漿超聲法提取梅花鹿茸多肽

實驗步驟同1.2.1，勻漿后超聲0.5 h，在超聲機中加入適量的冰塊，超聲提取后于4℃、以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min后吸取上清液，標(biāo)號后，4℃保存待測.

1.2.4 梅花鹿茸多肽純化

分別取3組鹿茸粗多肽溶液400 mL，用飽和度80%的硫酸銨沉淀分離上述溶液，操作在冰上進(jìn)行，并且不斷攪拌，待硫酸銨固體溶解，置于層析柜中過夜，離心收集到的沉淀經(jīng)透析除鹽后冷凍干燥，得到鹿茸多肽粉末.

1.2.5 蛋白含量測定

采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，具體操作步驟參照試劑盒說明書，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白含量.

1.3 細(xì)胞增殖作用的檢測

1.3.1 MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)蘇

具體步驟:1)從液氮罐中取出凍存的MC3T3-E1細(xì)胞，立即將凍存管放入37℃水浴鍋溶解，水浴解凍，輕搖凍存管，直到液體完全融化(水面不要超過冷凍管蓋沿);2)用75%醫(yī)用酒精消毒后再放入超凈工作臺中，補加適量新鮮的含血清的α-MEM培養(yǎng)液，將離心管蓋擰緊，用離心機800 r/min離心5 min;離心完畢后，棄去上清，保留細(xì)胞，再加入10 mL含血清的α-MEM培養(yǎng)液，溫柔地吹打細(xì)胞懸液，細(xì)胞吹勻后用移液器把細(xì)胞移至培養(yǎng)瓶中，十字輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，放置37℃、5%CO2的恒溫孵箱中培養(yǎng).

1.3.2 MC3T3-E1 細(xì)胞傳代

將MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件:37℃、5%CO2、相對濕度70%，定期于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況.隔2～3 d，應(yīng)用0.25%的胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)，具體步驟:1)棄掉培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基;2)用PBS清洗細(xì)胞，倒去清洗液;重復(fù)2次;3)加適量的0.25%胰蛋白酶于培養(yǎng)瓶中，使胰酶完全覆蓋于細(xì)胞層，置37℃培養(yǎng)箱中，消化約1～2 min;4)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，隨著時間的推移，消化后的細(xì)胞逐漸趨于圓形，細(xì)胞不再粘連成片;加入含血清的培養(yǎng)基，終止消化;5)吸取瓶內(nèi)消化液，吹打瓶壁，反復(fù)多次，使細(xì)胞從瓶壁脫離，形成懸液;6)將細(xì)胞懸液收集至15 mL離心管中，800 r/min，離心5 min，棄上清.加入新鮮α-MEM培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，計數(shù)，將其稀釋至合適的接種濃度，分瓶接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi).取生長良好的細(xì)胞用于后續(xù)實驗.

1.3.3 MC3T3-E1 誘導(dǎo)細(xì)胞

成骨細(xì)胞分化采用成骨培養(yǎng)基(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和100 μg/mL抗壞血酸)誘導(dǎo)細(xì)胞，并且每3 d更換成骨培養(yǎng)基.

1.4 MTT法檢測MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性

將 MC3T3-E1細(xì)胞濃度稀釋為3×103個/mL，吸取100 μL細(xì)胞懸液接種到96孔板中，放置37℃、5%CO2恒溫敷箱中培養(yǎng)24 h.細(xì)胞完全貼壁后，加藥孔分別加入含 100 μg/mL，10 μg/mL，1 μg/mL 鹿茸多肽的10%FBSα-MEM培養(yǎng)液100 μL.空白對照組為10%FBSα-MEM 培養(yǎng)液，每組6個復(fù)孔.放置37℃、5%CO2恒溫敷箱中繼續(xù)分別培養(yǎng)48，72 h.培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入0.5 mg/mL MTT溶液20 μL，于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，振蕩10 min，以酶標(biāo)儀測定550 nm波長下的吸光度.計算細(xì)胞增殖率:細(xì)胞增殖率=［A550nm(實驗組平均)－A550nm(空白對照組)］/A550nm(空白對照組).

1.5 茜素紅染色礦化分析

將MC3T3-E1細(xì)胞接種在6孔板上，并用勻漿法、勻漿裂解法和勻漿超聲法分別制得的鹿茸多肽，處理21 d后用成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞用PBS洗滌細(xì)胞3次，用4%多聚甲醛在4℃固定30min，并用去離子水沖洗.最后，將細(xì)胞用40 mmol/L茜素紅溶液(pH 4.4)在室溫下染色5～10 min，并用去離子水沖洗兩次，使用光學(xué)顯微鏡捕獲染色細(xì)胞的圖像.

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計學(xué)方法每組數(shù)據(jù)均測定3次，并計算平均值，求3個數(shù)據(jù)的SD(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)，繪圖與t檢驗通過GraphPad Prism 7軟件制得，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 實驗結(jié)果

2.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線及梅花鹿茸粗提液的可溶性蛋白含量

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1;梅花鹿茸粗提液可溶性蛋白含量見表1.

2.2 硫酸銨沉淀測定梅花鹿茸多肽含量

硫酸銨沉淀法測定梅花鹿多肽含量見表2.

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

表1 不同方法測定梅花鹿茸多肽提取率Tab.1 Extraction rate of sika velvet antler polypeptide measured by different methods η/%

表2 硫酸銨沉淀法測定梅花鹿茸多肽含量Tab.2 Contents of sika velvet antler polypeptide measured by ammonium sulfate precipitation ρ/(mg·mL－1)

2.3 梅花鹿茸多肽對MC3T3-E1細(xì)胞的促增殖作用

勻漿法、勻漿裂解法、勻漿超聲法提取梅花鹿茸多肽對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響，見圖2～4.

2.4 鹿茸多肽對MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響

礦化對于骨形成十分重要.為進(jìn)一步研究勻漿超聲法制得的鹿茸多肽對骨礦化的重要性，使用茜素紅染色進(jìn)行礦化的定量測定.鈣沉積物存在表明:與對照組(見圖5，A)比較，勻漿法(見圖5，B)、勻漿裂解法(見圖5，C)和勻漿超聲法(見圖5，D)在誘導(dǎo)21 d后，MC3T3-E1細(xì)胞中的礦化現(xiàn)象呈現(xiàn)遞增趨勢.這些數(shù)據(jù)表明:勻漿超聲法制得的鹿茸多肽可明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞礦化.

圖2 勻漿法提取的梅花鹿茸多肽對MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of of homogenate extracted sika deer antler polypeptide on proliferation of MC3T3-E1 cells

圖3 勻漿裂解法提取的鹿茸多肽對MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of homogenate lysate extracted sika deer antler polypeptide on the proliferation of MC3T3-E1 cells

圖4 勻漿超聲法提取的梅花鹿茸多肽對MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力的影響Fig.4 Effect of homogenate ultrasonic method on the proliferation of MC3T3-E1 cells

圖5 鹿茸多肽對MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響(100×)Fig.5 Effect of pilose antler polypeptide on mineralization of MC3T3-E1 cells

3 討 論

鹿茸是“東北三寶”之一，其功能廣泛，是傳統(tǒng)名貴藥材，鹿茸多肽作為鹿茸主要的藥理活性成分，有較高的臨床應(yīng)用價值.本實驗探討采用3種方法提取的鹿茸水溶性多肽對細(xì)胞活性影響，勻漿超聲法的各項指標(biāo)均高于勻漿裂解法和勻漿法，勻漿裂解法居次.從勻漿超聲法和勻漿法兩組可看出水溶性蛋白含量越高，活性也相應(yīng)越高，說明勻漿超聲工藝不但提高了水溶性多肽的含量，而且有利于活性保存.本實驗采用經(jīng)典硫酸銨沉淀法配合離心技術(shù)以獲取鹿茸蛋白的粗提物，然后用透析法除鹽，這種方法的優(yōu)點是蛋白質(zhì)的回收率高，并能將一般的非蛋白類物質(zhì)的小分子除去.

勻漿超聲法促MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性和礦化現(xiàn)象顯著高于勻漿法，裂解液法提取蛋白的步驟相對較多，提取時間長，可能會使蛋白發(fā)生降解，同時裂解液法中所用到的助溶劑中的幾種成分有細(xì)胞毒性［7-8］，勻漿裂解法對MC3T3-E1細(xì)胞活性不如勻漿法和勻漿超聲法.勻漿超聲法提取工藝簡單，步驟少，成本低，對活性無影響.比較提取多肽的含量，勻漿超聲的提取率為13.38%，勻漿裂解的提取率為15.56%，差距不大，又考慮到裂解液對后續(xù)細(xì)胞實驗的影響，所以勻漿超聲法更為適用.

綜上所述，勻漿法和勻漿超聲法提取鹿茸多肽更具臨床價值.本實驗表明:采用超聲法提取鹿茸多肽，不僅可以節(jié)約時間，而且還可提高鹿茸多肽的提取量，是較為理想的具有蛋白活性的鹿茸多肽.