曹星衛(wèi)，肖艷萍，鐘橋石，杭亞萍，陳艷慧，方雪瑤，劉艷華，胡龍華(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330006)

近年來，革蘭陰性桿菌臨床分離株多重耐藥性嚴(yán)重，尤其耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)上升趨勢明顯，2017年全國CRE檢出率高達(dá)9.4%[1]。黏菌素是目前國際上推薦用于治療多重耐藥革蘭陰性桿菌感染的“最后一道防線”[2]。隨著黏菌素在臨床使用量的增加，耐黏菌素腸桿菌科細(xì)菌已開始出現(xiàn)。2015年我國學(xué)者報(bào)道從人和動(dòng)物分離的腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1，自此揭開對(duì)黏菌素耐藥機(jī)制的新認(rèn)識(shí)[3]。目前在多個(gè)國家和地區(qū)人和動(dòng)物源的分離菌株中發(fā)現(xiàn)了該基因，且攜帶該基因的菌種分布廣，腸桿菌科細(xì)菌中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、阪崎腸桿菌、宋內(nèi)志賀菌及腸炎沙門菌等均有分離報(bào)道[3-4]。本研究就我院臨床分離的2株mcr-1陽性大腸埃希菌的耐藥特征和傳播機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2017年1—12月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院分離的90株非重復(fù)大腸埃希菌，用E-test 法對(duì)菌株進(jìn)行黏菌素藥敏初篩試驗(yàn)，共篩出2 株黏菌素耐藥菌株，其中1株(編號(hào)N408)于2017年1月分離自1名重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)男性患者腹水標(biāo)本，另1株(編號(hào)N433)于2017年2月分離自1名腫瘤科病區(qū)男性患者血液標(biāo)本；質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、陰溝腸桿菌029M、耐疊氮鈉大腸埃希菌J53以及沙門菌H9812菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要儀器及試劑 Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀及Vitek MS質(zhì)譜儀(法國生物梅里埃公司)，PCR儀(杭州朗基科學(xué)儀器公司)，CHEF.DR11型脈沖場電泳系統(tǒng)及普通電泳儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像儀(上海天能公司)，ABI 3730XL測序儀(杭州擎科生物公司)；2×PCR Master Mix、EB染液、常規(guī)瓊脂糖、TBE液、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海生工公司)，DNA marker(北京天根生化公司)，S1酶、XbaⅠ酶及蛋白酶K(日本TaKaRa公司)，黏菌素、疊氮鈉(北京索萊寶公司)，SeaKem Gold Agarose(美國Cambrex公司)，藥敏紙片(英國Oxoid公司)，黏菌素 E-test 藥敏條(意大利利飛馳公司)。

1.3菌株鑒定及藥物敏感性試驗(yàn) 用Vitek 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀和Vitek MS質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種鑒定,用AST-GN16藥敏卡進(jìn)行藥敏檢測，結(jié)果根據(jù)2018年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行判斷。利用微量肉湯稀釋法測定黏菌素的最低抑菌濃度(MIC)，大腸埃希菌ATCC25922用于質(zhì)控，藥敏折點(diǎn)參照 EUCAST 7.0版判讀標(biāo)準(zhǔn)(敏感：MIC≤2 μg/mL)[6]。

1.4產(chǎn)酶表型確證試驗(yàn) 用Vitek 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀檢測實(shí)驗(yàn)菌株是否產(chǎn)ESBLs，肺炎克雷伯菌ATCC700603和大腸埃希菌ATCC25922為ESBLs檢測的陽性和陰性質(zhì)控菌株；根據(jù)文獻(xiàn)[7]進(jìn)行三維試驗(yàn)檢測AmpC酶：提取酶粗提物于-80 ℃反復(fù)凍融，將調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏拇竽c埃希菌ATCC25922菌液涂布M-H瓊脂培養(yǎng)基，將頭孢西丁紙片貼在培養(yǎng)基中心，沿紙片邊緣向外劃線加入酶粗提物，35 ℃孵育過夜，以陰溝腸桿菌029M和大腸埃希菌ATCC25922分別作為AmpC酶陽性和陰性質(zhì)控菌株。

1.5耐藥基因檢測 用加熱煮沸法[8]提取細(xì)菌DNA并作為模板。根據(jù)文獻(xiàn)[8]和Permer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，序列見表1,由杭州擎科生物公司合成。用PCR檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M),AmpC酶基因(blaAAC、blaCIT、blaDHA、blaEBC、blaFOX、blaMOX),質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因[qnrA、qnrB、qnrS、acc(6′)-Ib-cr]和黏菌素耐藥基因mcr-1。PCR反應(yīng)體系50 μL，其中DNA模板1 μL、上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL、ddH2O 20 μL、2×PCR Master Mix 25 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，退火(各基因退火溫度見表1)30 s，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果。所有擴(kuò)增陽性產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后送杭州擎科生物公司采用桑格測序技術(shù)進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)拼接后與GenBank序列進(jìn)行比對(duì)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，確定耐藥基因。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.6接合試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[8]的方法，將2株大腸埃希菌和J53菌株接種在血瓊脂平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，分別挑取單菌落接種至5 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r/min 12 h。分別吸取供體菌(2株大腸埃希菌)200 μL和受體菌(J53)100 μL于4 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃靜置24 h。吸取混合菌懸液100 μL均勻涂布于含黏菌素(2 μg/mL)和疊氮鈉(200 μg/mL)的LB平板上。供體菌和受體菌同樣涂布含抗菌藥物L(fēng)B平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取篩選平板上單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)種血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，對(duì)接合子進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)、表型篩選試驗(yàn)以及后續(xù)的耐藥基因檢測。

1.7多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing, MLST) 參照網(wǎng)站(http://mlst.warwick.ae.uk/Mlst/dbs/Ecoli for Ecoli)合成大腸埃希菌7對(duì)管家基因引物(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA)，并根據(jù)相應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽性產(chǎn)物送杭州擎科公司進(jìn)行測序并拼接，將序列提交至MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè)管家基因的等位編號(hào)及序列分型(sequence type, ST)。

1.8脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) 將H9812菌株、2株大腸埃希菌菌液與低熔點(diǎn)膠混勻后灌模，蛋白酶K消化2 h，使用XbaI內(nèi)切酶消化4 h。配制10 g/L SeaKem Gold凝膠，在CHEF.DR11型脈沖場電泳系統(tǒng)上進(jìn)行PFGE。電泳參數(shù)6 V/cm，脈沖時(shí)間4～40 s，0.5×TBE電泳緩沖液，電場角度120°，電泳時(shí)間19 h。電泳后膠塊經(jīng)EB染色后成像觀察。

1.9S1酶切脈沖場凝膠電泳(S1-PFGE) 將H9812菌株、J53、2株大腸埃希菌及接合子分別灌模制膠，用XbaI內(nèi)切酶酶切H9812后作為marker，S1酶對(duì)J53、2株大腸埃希菌及接合子進(jìn)行酶切；電泳參數(shù)同1.8，電泳后膠塊經(jīng)EB染色后成像觀察。

2 結(jié)果

2.1菌株鑒定及藥敏結(jié)果 2株菌均為大腸埃希菌。藥敏結(jié)果顯示N408及接合子JN408對(duì)除頭孢吡肟和碳青霉烯類外的其他β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、黏菌素耐藥，對(duì)氨基糖苷類和替加環(huán)素敏感。N433及接合子JN433對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類、替加環(huán)素敏感，而對(duì)喹諾酮類及黏菌素耐藥。見表2。

表2 供體菌、受體菌及接合子的藥敏試驗(yàn)結(jié)果(μg/mL)

2.2產(chǎn)酶表型結(jié)果 N408和N433及其接合子檢測產(chǎn)ESBLs試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；N408及其接合子三維試驗(yàn)陽性，N433及其接合子為陰性。

2.3耐藥基因結(jié)果 PCR擴(kuò)增及測序比對(duì)結(jié)果顯示N408和JN408均攜帶mcr-1和blaCIT基因；N433攜帶mcr-1和blaTEM-1基因，JN433僅攜帶mcr-1基因，其余基因檢測結(jié)果均為陰性。見圖1。

2.4接合試驗(yàn)結(jié)果 接合子JN408和JN433均能在含黏菌素和疊氮鈉的平板上生長，表明接合試驗(yàn)成功。2株接合子均對(duì)黏菌素耐藥，且均檢測到mcr-1基因。

2.5MLST結(jié)果 N408為ST453型，N433為ST8900型。

2.6PFGE和S1-PFGE結(jié)果 PFGE結(jié)果顯示2株菌條帶明顯不同，見圖2。S1-PFGE結(jié)果顯示N408含有2個(gè)質(zhì)粒，質(zhì)粒大小分別為78 000 bp和138 000 bp左右，JN408僅含1個(gè)78 000 bp左右的質(zhì)粒；N433和JN433均含1個(gè)33 000 bp左右的質(zhì)粒，見圖3。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)2株攜帶mcr-1基因的耐黏菌素大腸埃希菌，為江西地區(qū)首次報(bào)道。研究報(bào)道黏菌素耐藥臨床分離菌株通常呈現(xiàn)多重耐藥性[3]。但本研究的2株菌株對(duì)碳青霉烯類藥物均敏感，尤其是菌株N433除對(duì)氨芐西林、喹諾酮類及黏菌素耐藥外，對(duì)其余16種檢測藥物均敏感，表明臨床分離黏菌素耐藥菌株也可呈現(xiàn)對(duì)多種抗菌藥物敏感，這同浙江地區(qū)報(bào)道類似[9]。雖然對(duì)黏菌素耐藥，但對(duì)碳青霉烯類、替加環(huán)素等抗菌藥物保持敏感性。對(duì)于這類菌株感染的患者仍有可選的抗菌藥物可供治療。對(duì)2株菌株分別檢測ESBLs類、AmpC類、喹諾酮類及黏菌素類等14種耐藥基因，檢測結(jié)果與耐藥表型一致，2株菌均檢出mcr-1基因，菌株N408同時(shí)檢出blaCIT基因；而對(duì)氨芐西林耐藥，對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類敏感的菌株N433僅檢出窄譜β-內(nèi)酰胺酶基因blaTEM-1。2株菌接合試驗(yàn)均成功將mcr-1基因轉(zhuǎn)移到受體菌中，表明mrc-1基因可通過質(zhì)粒在菌種之間水平傳播，這與目前研究的黏菌素耐藥機(jī)制一致[3]。同時(shí)提示臨床應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)此類細(xì)菌的監(jiān)測，防止mcr-1轉(zhuǎn)移至其他耐藥菌株間，產(chǎn)生泛耐藥菌株。S1-PFGE結(jié)果顯示接合子JN408和JN433均檢測到一個(gè)質(zhì)粒，大小分別約為78 000 bp和33 000 bp，由于未進(jìn)行Southern blot雜交實(shí)驗(yàn)，但接合子菌均僅含1個(gè)質(zhì)粒，可初步推測這2株菌的mcr-1基因位于上述質(zhì)粒上。其中編號(hào)N433菌株中mcr-1位于約33 000 bp大小的質(zhì)粒上，與黃旭等[10]報(bào)道的1例大腸埃希菌中攜帶mcr-1基因的質(zhì)粒大小一致。

2株攜帶mcr-1基因大腸埃希菌ST型分別為ST453和ST8900，與國內(nèi)外報(bào)道的ST156、ST167、ST648、ST10、ST2736等[3,11-13]有所不同，是新發(fā)現(xiàn)的攜帶mcr-1基因不同ST型大腸埃希菌。這可能是導(dǎo)致黏菌素耐藥菌株對(duì)其他藥物敏感性不同于其他黏菌素耐藥菌株對(duì)多種藥物耐藥的原因。2株菌的MLST分型和PFGE結(jié)果均不同，提示菌株同源性不高，且分屬不同的克隆種群，表明2株菌為非克隆傳播。查閱2名患者的住院病歷，發(fā)現(xiàn)感染患者分別入住不同科室，且2個(gè)科室分別在不同住院大樓，2名患者住院時(shí)間也無交集，患者近期也沒有外出旅行史，提示菌株來源不明確，存在散發(fā)傳播的可能。