朱曉燕，徐俊馳，沈強，吳敏娟，宋華峰，黃麗娜，周梅鶴，胥萍(. 蘇州市第五人民醫(yī)院檢驗中心，江蘇蘇州 53；. 蘇州市疾病預(yù)防控制中心，江蘇蘇州5007)

新型冠狀病毒屬于單鏈RNA病毒，是一種新型β屬冠狀病毒，其基因組序列約29 000 bp，含有10個基因，可有效編碼10個蛋白質(zhì)[1-2]。2019年12月在湖北省武漢市出現(xiàn)該病毒感染人類引起肺炎病例[3]，隨著疫情的迅速蔓延和發(fā)展，迫切需要對具有臨床癥狀的患者及疑似患者進行有效、快速的診斷和鑒別診斷。新型冠狀病毒核酸檢測能為新型冠狀病毒感染診斷提供病原學(xué)證據(jù)，但受多種因素影響，檢測數(shù)據(jù)易出現(xiàn)假陰性、假陽性情況。本研究圍繞目前醫(yī)院開展新型冠狀病毒核酸檢測中常用的RT-PCR法中出現(xiàn)高循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct值)樣本進行初步分析和討論。

1 材料與方法

1.1樣本 2020年2月14日至2月30日蘇州市各醫(yī)院新型冠狀病毒核酸檢測Ct值≤38的樣本24例；樣本類型為鼻咽拭子及肛拭子，采樣后置于同一病毒采樣管中送檢。

1.2儀器及試劑 MagNA Pure 96全自動核酸純化儀、Light Cycle 480實時熒光PCR儀(美國Roche公司)，ABI 7500實時熒光PCR儀(美國ABI公司)；MagNA Pure 96純化試劑及其配套系列耗材(美國Roche公司),新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(上海伯杰公司)。

1.3方法

1.3.1樣本處理及核酸提取 樣本核酸純化處理前于56 ℃滅活30 min[4-5]。從病毒保存管中吸取200 μL樣本至MagNA Pure 96處理槽，將處理槽內(nèi)待檢樣本置于MagNA Pure 96全自動核酸純化儀內(nèi)，根據(jù)操作程序，機器自動進行核酸純化。

1.3.2核酸擴增 按新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒說明書配制25 μL反應(yīng)體系，包括核酸擴增反應(yīng)液12 μL、酶混合液4 μL、ORF1ab/N反應(yīng)液4 μL，樣本核酸5 μL。檢測靶點為ORF1ab及N 2個靶標，試劑盒帶內(nèi)參。按照試劑說明書中反應(yīng)條件設(shè)定程序，進行實時熒光RT-PCR反應(yīng)。分別在Light Cycle 480實時熒光PCR儀、ABI 7500實時熒光PCR儀上進行。

1.3.3結(jié)果分析 根據(jù)陰性對照的擴增曲線調(diào)節(jié)起止值，進行分析。根據(jù)試劑說明書提供的結(jié)果判定標準(見表1)，檢測結(jié)果利用ROC曲線法確定ORF1ab、N參考值Ct值均為38。將Ct值為 33～38的樣本定義為高Ct值樣本。

表1 結(jié)果判定標準

2 實驗與結(jié)果

2.1試劑盒檢出限驗證結(jié)果 陽性對照(濃度為106～107copies/mL)經(jīng)1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000、1∶1 000 000 6個梯度稀釋，驗證結(jié)果與試劑盒說明書相符，檢出限為103copies/mL，Ct值最低為23.66。

2.2實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果

2.2.1同一樣本核酸在同一實驗室不同品牌基因擴增儀上檢測結(jié)果 9例Ct值≤38樣本，其中有7例高Ct值樣本(33≤Ct值≤38)，2例低Ct值樣本(Ct值<33)。對9例樣本分別在同一實驗室ABI 7500擴增儀和Light Cycle 480擴增儀上進行實時熒光PCR，結(jié)果7例高Ct值樣本有6例同一樣本核酸在Light Cycle 480及ABI 7500 2臺擴增儀的檢測結(jié)果不一致，包括ORF1ab基因檢測結(jié)果不一致4例，N基因不一致4例，其中ORF1ab基因和N基因均不一致2例，見表2；而Ct值<33的核酸樣本復(fù)檢結(jié)果一致，Ct值仍<33。

表2 7例高Ct值同一核酸樣本在ABI 7500及Light Cycle 480擴增儀檢測結(jié)果比較

2.2.2ORF1ab基因單靶位高Ct值患者重復(fù)采樣核酸檢測結(jié)果 有8例ORF1ab基因單靶位高Ct值樣本首次檢測Ct值分別為36.51、35.97、35.29、35.41、35.61、36.20、36.48、36.80(見圖1)。次日重復(fù)采樣，同試劑同儀器再次檢測，結(jié)果雙靶標均為陰性(見圖2)。

2.2.3高Ct值樣本不同實驗室相同基因擴增儀復(fù)檢結(jié)果 有7例咽拭子肛拭子混合液樣本(其中5例33≤Ct值≤38，2例Ct值<33)在本實驗室檢測后，送蘇州市另一基因擴增實驗室相同品牌儀器上檢測，結(jié)果5例高Ct值的樣本不同實驗室相同基因擴增儀結(jié)果均不一致(見表3)；2例低Ct值樣本不同實驗室陰陽性檢測結(jié)果一致，Ct值仍<33。

表3 高Ct值同一樣本在不同實驗室相同基因擴增儀復(fù)檢結(jié)果不一致

3 討論

本實驗自檢測新型冠狀病毒核酸以來出現(xiàn)以下現(xiàn)象：同一患者重復(fù)采樣結(jié)果不一致；同一檢測樣本及其核酸在同一實驗室不同基因擴增儀上結(jié)果不一致；同一樣本在不同實驗室間相同型號儀器檢測結(jié)果不一致；同時本實驗室針對試劑盒的檢出限進行驗證，證明所用試劑盒檢測靈敏度具備本文中高Ct值樣本的檢測能力。

針對以上高Ct值樣本復(fù)檢后結(jié)果出現(xiàn)不符的現(xiàn)象，筆者分析影響檢測結(jié)果各環(huán)節(jié)中的因素。首先，目前新型冠狀病毒實驗室檢測路徑未標準化，所用的核酸檢測試劑盒研發(fā)時間緊迫，尚缺乏足夠的評估及大樣本的臨床驗證。其次，不同樣本類型對新型冠狀病毒的核酸檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，本實驗標本為咽拭子及肛拭子病毒采樣液，而在最新版診療方案中，其確診所提到的核酸檢測樣本類型不僅包含呼吸道樣本及血液樣本，同時在實驗室檢查中增加“糞便樣本中可檢測新型冠狀病毒核酸[1]”。臨床上多數(shù)患者咳痰困難，下呼吸道灌洗液樣本難以取得，且操作的生物安全風(fēng)險極大，故呼吸道樣本以鼻咽拭子及咽拭子為主，而拭子樣本采用目前的RT-PCR試劑盒，據(jù)估計陽性檢出率只有30%～50%，大量的假陰性結(jié)果無法避免，必須多次取樣檢測或結(jié)合其他類型樣本檢查結(jié)果。

有研究發(fā)現(xiàn)，分別采集新型冠狀病毒疑似病例呼吸道不同類型樣本進行核酸檢測，咽拭子樣本中新型冠狀病毒陽性檢出率低于深部痰樣本，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；病毒含量的降低可出現(xiàn)同一患者重復(fù)采樣核酸檢測結(jié)果不一致的現(xiàn)象。不同呼吸道樣本取樣材料對新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果也產(chǎn)生影響。有研究在確診患者中比較了帶病毒保存液的植絨拭子樣本及無病毒保存液的普通棉簽拭子樣本中新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)普通棉簽拭子的核酸檢出率明顯低于帶病毒保存液的植絨拭子(P<0.05)，普通棉簽拭子即便檢出，其陽性Ct值也顯著大于植絨拭子[6]。本實驗室所用采樣樣本為普通棉簽拭子和植絨拭子各自取樣后置于同一病毒采樣管中形成的混合溶液，可能會降低核酸的陽性檢出率。目前相關(guān)的診療方案及實驗室檢測指南并未提及用于采集鼻咽拭子及咽拭子的拭子種類，但對于呼吸道樣本的病毒核酸檢測來說，不同的拭子及保存管可能影響核酸檢測結(jié)果，但相關(guān)影響因素尚未見報道。目前我們采用的病毒采樣管的保存液為Hanks液，其對于新型冠狀病毒RNA保存的穩(wěn)定性尚無研究，另外采樣過程中RNA酶的污染也可導(dǎo)致核酸檢測陽性率隨著保存時間的延長而降低。因此，本實驗室出現(xiàn)當天檢測的陽性樣本經(jīng)過4 ℃保存、次日檢測出現(xiàn)陰性結(jié)果的現(xiàn)象。

至于本實驗室出現(xiàn)當天檢出陽性樣本的核酸，經(jīng)-20 ℃凍存過夜，次日復(fù)溶后再次在另一臺核酸擴增儀上進行擴增，高Ct值出現(xiàn)結(jié)果不一致的現(xiàn)象，分析原因可能是，RNA病毒經(jīng)凍融后出現(xiàn)降解。次日檢測未同時在2臺儀器上檢測，在今后的研究中可增加樣本量并進行2臺儀器同時檢測。

針對目前出現(xiàn)的以上關(guān)于新型冠狀病毒核酸檢測的問題及疑惑，僅以核酸檢測為金標準，同時在某個階段配合新型冠狀病毒抗原或IgM及IgG抗體；或者采用更靈敏的核酸檢測方法，如數(shù)字PCR；或通過病毒快速富集儀進行富集，提高病毒濃度，進而增加檢測的靈敏度和準確性等措施，可提高新型冠狀病毒核酸檢測能力，盡可能降低假陰性或假陽性。