田鵬鵬，王嫻默，伍嘉豪，王立，范文，朱麗莎(長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北荊州 434000)

2019年12月，武漢暴發(fā)新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情[1-2]，給公共衛(wèi)生防控和臨床診治帶來巨大挑戰(zhàn)。目前COVID-19尚缺乏特效治療，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離、早治療具有十分重要的意義，但目前確診主要依據(jù)新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)核酸檢測，由于標(biāo)本采集與存放、檢測靈敏度、病毒感染部位等各方面因素，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果[3-4]。因此，新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)[5]中指出，當(dāng)疑似病例中血清SARS-CoV-2特異性IgM抗體和IgG抗體陽性、IgG抗體滴度恢復(fù)期較急性期有4倍及以上升高也可確診，故需要血清學(xué)抗體檢查來輔助診斷COVID-19。為了評估新型冠狀病毒特異性IgM/IgG抗體的診斷價(jià)值，特對本院中確診、疑似以及其他患者的抗體水平進(jìn)行研究，具體如下。

1 資料和方法

1.1一般資料 收集2020年1月1日至3月13日在長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)確診患者108例，男53例、女55例，年齡(53.0±18.9)歲；疑似患者23例，男10例、女性13例，年齡(43.0±6.4)歲；排除COVID-19的其他肺部感染住院患者20例，男11例、女9例，年齡(55.0±10.4)歲；其他疾病患者15例，男9例、女6例，年齡(63.0±16.5)歲，包括糖尿病3例，心肌梗死4例，急診外科手術(shù)8例；看護(hù)COVID-19患者的健康醫(yī)務(wù)工作者55例，男26例、女29例，年齡(36.5±12.5)歲。對所有研究對象均進(jìn)行SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測和核酸檢測。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 所有患者均符合國家衛(wèi)生健康委員會《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》中COVID-19診斷標(biāo)準(zhǔn)。疑似病例：結(jié)合流行病學(xué)史和臨床表現(xiàn)綜合分析。確診病例入院時的臨床分型：(1)輕型：臨床癥狀輕微，影像學(xué)檢查未見肺炎表現(xiàn)。(2)普通型：具有發(fā)熱、呼吸道等癥狀，影像學(xué)檢查可見肺炎表現(xiàn)。(3)重型，符合下列任何一條：出現(xiàn)氣促，呼吸頻率≥30次/min；靜息狀態(tài)下，手指血血氧飽和度≤93%；動脈血氧分壓(PaO2)/吸氧濃度(FiO2)≤300 mmHg。(4)危重型，符合下列任何一條：出現(xiàn)呼吸衰竭，且需要機(jī)械通氣；出現(xiàn)休克；或合并其他器官功能衰竭需ICU監(jiān)護(hù)治療。

1.3主要儀器和試劑 iFlash3000i化學(xué)發(fā)光測定儀(亞輝龍公司),ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；SARS-CoV-2 IgG抗體和IgM抗體檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光法，亞輝龍公司)，2019新型冠狀病毒(ORF1ab/N基因)核酸檢測試劑盒(上海伯杰公司)。

1.4SARS-CoV-2 IgM抗體和IgG抗體檢查 將新鮮抽取的患者血液樣本加入紅色無抗凝劑試管中，室溫靜置后進(jìn)行離心，嚴(yán)格按照儀器和試劑盒操作說明書進(jìn)行SARS-CoV-2 IgM抗體和IgG抗體檢測?？乖煞譃镾ARS-CoV-2抗原(重組蛋白)，更換批號時使用校準(zhǔn)品校準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)分析時以IgM≥10 Au/mL、IgG≥10 Au/mL為陽性，IgM<10 Au/mL、IgG<10 Au/mL為陰性。

1.5SARS-CoV-2核酸檢測 采集患者的咽拭子，用雙重?zé)晒釸T-PCR法進(jìn)行檢測。靶標(biāo)一ORF1ab基因正向引物(F)：5′-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3′；反向引物(R)：5′-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3′；熒光探針(P)：5′-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAG

GTTATGG-BHQ1-3′。 靶標(biāo)二N基因正向引物(F)：5′-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3′；反向引物(R)：5′-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3′；熒光探針(P)：5′-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3′。核酸檢測陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)：同一份標(biāo)本中病毒ORF1ab和N基因檢測同時陽性；同一患者不同的2份標(biāo)本中病毒ORF1ab或N基因檢測陽性。每次核酸檢測均同時進(jìn)行陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控。

2 結(jié)果

2.1COVID-19患者的一般臨床資料 COVID-19患者共108例，年齡范圍4個月～89歲，人群普遍易感；首發(fā)癥狀主要是發(fā)熱(65.7%)、咳嗽(37.0%)、乏力(15.7%)；無癥狀患者共4例(3.7%)，其中1例是腫瘤復(fù)查肺部CT而確診，3例是密切接觸者篩查而確診。普通型患者與重型/危重型患者臨床資料比較結(jié)果見表1。

表1 COVID-19患者的一般臨床資料[n(%)]

2.2SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果 108例確診患者核酸檢測均為陽性，23例疑似患者、45例非COVID-19患者及55例看護(hù)人員核酸檢測均為陰性。

2.3SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體檢測結(jié)果 在108例COVID-19確診患者中IgM單一陽性率為64.8%，IgG單一陽性率為93.5%，IgM或IgG任一陽性率為98.1%。以RT-PCR結(jié)果為比對標(biāo)準(zhǔn)，IgM/IgG任一陽性的敏感性為98.1%、特異性為89.4%、準(zhǔn)確性為93.7%、陽性似然比為9.24，陰性似然比為0.02。見表2。在23例疑似COVID-19患者中5例IgM陽性，6例IgG陽性，共6例IgM或IgG任一陽性；在45例非COVID-19患者和55例看護(hù)人員中，3例IgM陽性，5例IgG陽性，共6例IgM或IgG任一陽性。

表2 SARS-CoV-2特異性IgG和IgM抗體的方法學(xué)評價(jià)

2.4不同型別之間抗體陽性率的差異 普通型和重型/危重型COVID-19患者之間，IgM/IgG陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.933，P=0.525)。

2.5同一患者不同時間段抗體水平比較 通過對有限的患者進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，出院后第14天COVID-19患者血清IgG水平比出院當(dāng)天下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.087，P=0.001)，但I(xiàn)gM水平無明顯變化(t=1.395，P=0.257)。對比出院后第14天和第16天的IgM(t=1.610，P=0.142)和IgG(t=1.015，P=0.336)，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是第28天相比第26天，IgM(t=2.794，P=0.049)和IgG(t=26.902，P=0.000)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 同一患者不同時間段抗體水平的變化

3 討論

從COVID-19暴發(fā)以來，國家衛(wèi)生健康委員會在《新型冠狀病毒肺炎診療方案》試行第1～6版中確診病例的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)都是核酸檢測或測序證實(shí)，但是臨床檢驗(yàn)科常用RT-PCR檢測病毒核酸，受各種因素影響，易造成假陰性結(jié)果，而且在條件有限的實(shí)驗(yàn)室還不能常規(guī)開展，嚴(yán)重影響確診或排除COVID-19。故新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)明確提出，SARS-CoV-2特異性IgM抗體和IgG抗體檢測也可作為確診依據(jù)之一。血清特異性抗體檢測有標(biāo)本更易標(biāo)準(zhǔn)采集、操作簡便、耗時更少、設(shè)備條件要求不高等優(yōu)勢，更易在臨床實(shí)驗(yàn)室開展。機(jī)體免疫系統(tǒng)是抵御病原體入侵的重要防線，當(dāng)SARS-CoV-2病毒入侵后，其特定蛋白如S蛋白和N蛋白等會刺激免疫系統(tǒng)引起抗體應(yīng)答，最早出現(xiàn)的抗體是IgM及其后的IgA抗體，然后是IgG抗體。按照急性感染的一般過程，當(dāng)IgG抗體出現(xiàn)后，濃度會持續(xù)增高，IgM則會持續(xù)降低直至消失，IgG抗體會較長時間存在。因此我們需要同時檢測血清特異性IgM抗體和IgG抗體，COVID-19作為新發(fā)的傳染病，其抗體檢測的臨床診斷價(jià)值還有待進(jìn)一步研究。

本研究患者的一般臨床資料與試行第七版中描述一致。我們以RT-PCR核酸檢測結(jié)果為比對標(biāo)準(zhǔn)，評估SARS-CoV-2特異性IgM/IgG抗體聯(lián)合檢測的臨床敏感性、特異性、準(zhǔn)確性分別為98.1%、89.4%、93.7%，與梁穎[6]、徐萬洲[7]等研究結(jié)果一致，但敏感性更高，與臨床確診病例有很好的一致性。此外特異性IgM抗體/IgG抗體陽性率與疾病的分型無關(guān)，與羅效梅等[8]結(jié)果相同，符合免疫學(xué)規(guī)律。但本研究中IgG陽性率要高于IgM，與徐萬洲等[7]研究結(jié)果更相近，可能原因是由于特異性抗體檢測試劑盒研發(fā)應(yīng)用較晚，我們收集的病例多是處于中晚期或者恢復(fù)期，甚至一部分是治愈出院的觀察期患者，故本研究中IgG抗體陽性率高于IgM。

本研究使用化學(xué)發(fā)光法檢測血清抗體，在臨床標(biāo)本中的一些干擾物質(zhì)會導(dǎo)致假陽性結(jié)果，如溶血、脂血、微生物污染、出現(xiàn)凝塊或絮狀物等情況。本研究中看護(hù)的健康醫(yī)務(wù)工作者55例和其他病毒性肺炎20例各有1例出現(xiàn)IgG陽性，無IgM陽性，但在其他疾病15例中出現(xiàn)了IgM/IgG陽性4例，特別是2例有精神疾病和癲癇病史的IgM水平特別高(>200 Au/mL)，提示有特定病史可能會導(dǎo)致異常結(jié)果，另外特異性抗體檢測用于疑似人群篩查時，應(yīng)關(guān)注其假陽性的問題，避免帶來不必要的混亂。有6例疑似COVID-19患者IgG陽性(IgG幾乎都>100 Au/mL)，同時其中5例IgM陽性，很大可能是因?yàn)槠涮幱贑OVID-19急性期但各種原因?qū)е潞怂釞z測假陰性，復(fù)測核酸仍然是陰性，未進(jìn)行抗體復(fù)測。另外IgG和IgM均陰性的疑似患者17例，未追蹤后續(xù)抗體和核酸檢測結(jié)果，若間隔一周再次抗體檢測仍為陰性則基本可以排除COVID-19。有2例COVID-19確診患者，但是其IgM/IgG均是陰性，表明其抗體檢測由于窗口期的存在，仍然存在假陰性的可能。故核酸RT-PCR檢測聯(lián)合特異性IgM/IgG抗體動態(tài)檢測，可以更準(zhǔn)確地診斷或排除COVID-19。

借助有限的幾個COVID-19病例研究，發(fā)現(xiàn)出院后第14天的IgG抗體水平比出院當(dāng)天顯著下降，IgM下降不明顯，出院后第28天比第26天的IgM和IgG水平均明顯下降，說明其抗體水平的變化與時間存在一定的相關(guān)性，關(guān)于IgM和IgG抗體產(chǎn)生、消失的規(guī)律變化還有待更進(jìn)一步的研究。

綜上所述，COVID-19患者主要癥狀是發(fā)熱、咳嗽、乏力，不發(fā)熱和無癥狀的患者也有相當(dāng)一部分，值得關(guān)注。SARS-CoV-2特異性IgM抗體/IgG抗體可以聯(lián)合SARS-CoV-2核酸檢查，提高COVID-19診斷的敏感性和準(zhǔn)確度，有必要進(jìn)一步研究血清中抗體的變化趨勢，以更好地用于COVID-19診斷和治療。