王賽賽，潘麗萍，姜廣路，李自慧，賈紅彥，孫琦，張宗德，劉洋(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院&北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所.流行病學(xué)研究室，.耐藥結(jié)核病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，.國(guó)家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室，北京101149)

廣泛存在于自然界中的非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)主要侵犯宿主肺、淋巴結(jié)、骨骼、關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織等并造成全身播散[1]。鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumavium-intracellularecomplex，MAC)是我國(guó)臨床標(biāo)本中分離率最高的NTM[2]。其中，鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium，MA)占艾滋病患者合并MAC感染的98%[3]，合并NTM感染的95%以上[4]，在醫(yī)學(xué)界引起廣泛重視。

由MAC感染引起的鳥分枝桿菌病，早期癥狀不明顯，多是發(fā)展到中后期通過X光片和CT檢查才被發(fā)現(xiàn)[5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)不斷改進(jìn)和完善，特別是實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)的逐步應(yīng)用為MA在基因診斷水平的研究提供了重要技術(shù)支撐。與普通PCR相比，基于SYBR Green Ⅰ熒光染料的qPCR熔解曲線法可縮短檢測(cè)時(shí)間、降低交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)[6]。因此，本研究基于SYBR Green Ⅰ熒光染料建立鑒定MA的qPCR方法，并以PCR-DNA直接測(cè)序技術(shù)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，評(píng)估其對(duì)臨床分離株的鑒定效果，為今后臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株種類及來源 21種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株包括鳥分枝桿菌(ATCC 25291)、胞內(nèi)分枝桿菌(ATCC 13950)、膿腫分枝桿菌(ATCC 19977)、龜分枝桿菌(ATCC 14472)、堪薩斯分枝桿菌(ATCC 12478)、戈登分枝桿菌(ATCC 14470)、偶發(fā)分枝桿菌(ATCC 6481)、草分枝桿菌(ATCC 11758)、金色分枝桿菌(ATCC 23366)、瘰疬分枝桿菌(ATCC 19981)、淺黃分枝桿菌(ATCC 43909)、恥垢分枝桿菌(ATCC 19420)、結(jié)核分枝桿菌(ATCC 27294)、馬爾摩分枝桿菌(ATCC 29571)、猿猴分枝桿菌(ATCC 25275)、蘇加分枝桿菌(ATCC 35799)、豬分枝桿菌(ATCC 33776)、土地分枝桿菌(ATCC 15755)、微黃分枝桿菌(ATCC 14474)、迪氏分枝桿菌(ATCC 19340)、施氏分枝桿菌(ATCC 27962)。5種常見致病菌包括金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)、大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、藤黃微球菌(CMCC 28001)、腐生葡萄球菌(ATCCBAA750)。21種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、藤黃微球菌均來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院國(guó)家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室；金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、腐生葡萄球菌均來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科。200株分枝桿菌臨床分離株分離自2019年1月至10月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院疑似分枝桿菌感染患者的痰標(biāo)本，所有樣本經(jīng)40 g/L氫氧化鈉處理后，接種于酸性羅氏培養(yǎng)基，分離株通過測(cè)定16S rDNA、rpoB、hsp65和ITS-1中2個(gè)序列進(jìn)行菌種鑒定，并采用Middlebrook 7H9培養(yǎng)基(含10%甘油)保存于-70 ℃超低溫冰箱。

1.2主要試劑及儀器 SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(SYBR Green)、2×Taq PCR Master Mix、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(北京天根生化科技公司)；PCR儀、Universal Hood Ⅱ凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，ABI 3730XL基因測(cè)序儀、QuantStudio 7 Flex實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)ThermoFisher Scientific公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌株處理及DNA提取 21種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和200株分枝桿菌臨床分離株接種于中性羅氏培養(yǎng)基；5種常見致病菌接種于哥倫比亞血瓊脂平板。待培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，刮取一接種環(huán)細(xì)菌至500 μL滅菌去離子水中，煮沸15 min，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2引物設(shè)計(jì) 依據(jù)參考文獻(xiàn)[7-8]及分枝桿菌菌種鑒定DNA序列比對(duì)系統(tǒng)(http://172.16.0.32:8081/NLC/pages/frame/home.jsp#)確定MA的特異序列IS1311和NTM的通用引物序列；用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)檢測(cè)序列特異性，用Oligo 7.0 軟件設(shè)計(jì)、評(píng)估引物，所有引物由上海生工公司合成。見表1。

表1 鳥分枝桿菌特異引物及NTM通用引物序列

1.3.3SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法的建立 總反應(yīng)體系20 μL，包括2×SuperReal預(yù)混試劑增強(qiáng)版10 μL、10 μmol/L IS1311-3基因上、下游引物各0.6 μL、樣本DNA 2 μL(終濃度為0.56 ng/μL)、50×Rox Reference Dye 0.4 μL、ddH2O 6.4 μL;陰性對(duì)照為ddH2O代替模板DNA，其余條件均相同。對(duì)21種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌和5種常見致病菌的DNA分別加樣后用渦旋振蕩器振蕩混勻、低溫超速離心機(jī)離心數(shù)秒，再快速轉(zhuǎn)至QuantStudio 7 Flex實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃10 s、60 ℃(已在溫度分別為59.5 ℃、59.8 ℃、60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃的梯度PCR中驗(yàn)證為最佳退火溫度)32 s(采集熒光信號(hào))，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后熔解曲線以1.6 ℃/s的速度完成95 ℃15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃(采集熒光信號(hào))15 s的程序。對(duì)所有標(biāo)準(zhǔn)菌株的擴(kuò)增曲線和熔解曲線進(jìn)行分析，以樣本在30個(gè)循環(huán)內(nèi)有擴(kuò)增曲線、在對(duì)應(yīng)熔解溫度(melting temperature, Tm)出現(xiàn)相應(yīng)的熔解峰為檢出標(biāo)準(zhǔn)，判定為MA。將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送生工公司進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后切下目的條帶，并用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化，將純化成功樣本經(jīng)連接反應(yīng)、轉(zhuǎn)化反應(yīng)后用SanPrep核酸純化套件(質(zhì)粒提取)試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，用即用PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增鑒定、瓊脂糖凝膠電泳，將檢測(cè)成功樣本進(jìn)行BDT反應(yīng)后置于YG96梯度PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用酒精純化后加入高度去離子甲酰胺混勻，最后轉(zhuǎn)至ABI 3730XL基因測(cè)序儀進(jìn)行Sanger克隆測(cè)序，結(jié)果與GenBank號(hào)為U16276.1的序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3.4普通PCR基因測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定 對(duì)21種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的hsp65基因、5種常見致病菌的16S rDNA基因和200株臨床分離株的hsp65和16S rDNA基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增測(cè)序。普通PCR總反應(yīng)體系50 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 25 μL、10 μmol/L上、下游引物各1 μL、樣本DNA 2 μL(終濃度為0.23 ng/μL)、ddH2O 21 μL；陰性對(duì)照為ddH2O代替模板DNA，其余條件均相同。菌株DNA分別加樣后使用渦旋振蕩器振蕩混勻，低溫超速離心機(jī)離心數(shù)秒再快速轉(zhuǎn)至Bio-Rad PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。21種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌及5種常見致病菌的DNA各取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)將所有菌株擴(kuò)增產(chǎn)物送生工公司進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后切下目的條帶，并用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化，將純化成功樣本進(jìn)行BDT反應(yīng)后置于YG96梯度PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用酒精純化后加入高度去離子甲酰胺混勻，最后轉(zhuǎn)至ABI 3730XL基因測(cè)序儀進(jìn)行Sanger雙向測(cè)序，正反向測(cè)序片段采用DNAMAN 8軟件拼接，結(jié)果用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中相應(yīng)菌種hsp65和16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析。

1.3.5初步應(yīng)用 用SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法對(duì)200株臨床菌株(每個(gè)樣本平行3份)進(jìn)行檢測(cè)，記錄擴(kuò)增結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 24.0軟件進(jìn)行。鑒定結(jié)果用株和百分率表示，用連續(xù)校正的χ2檢驗(yàn)分析SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法鑒定出MA的百分率與以hsp65、16S rDNA基因擴(kuò)增測(cè)序后鑒定出MA的百分率的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將測(cè)序結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，比較建立的方法鑒定MA的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率。一致性用Kappa檢驗(yàn)，Kappa<0.4，認(rèn)為一致性較差；0.4≤Kappa<0.75，認(rèn)為一致性一般；Kappa≥0.75，認(rèn)為一致性較好。

2 結(jié)果

2.1SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法的建立

2.1.1SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法的特異性 該方法僅與MA標(biāo)準(zhǔn)菌株在30個(gè)循環(huán)內(nèi)有擴(kuò)增曲線，與其他20種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、5種常見致病菌均無擴(kuò)增曲線，特異性為100%。見圖1。

2.1.2MA標(biāo)準(zhǔn)菌株IS1311-3擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序 將MA標(biāo)準(zhǔn)菌株IS1311-3擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的U16276.1進(jìn)行比對(duì)，其一致性為100%，見圖2。說明本研究中設(shè)計(jì)的特異性引物以MA為模板可擴(kuò)增出IS1311序列，擴(kuò)增效果良好。

2.1.3SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法的檢測(cè)限 用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量MA標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA濃度為5.6 ng/μL，將該DNA溶液用ddH2O以連續(xù)10倍等比稀釋(10-1、10-2、10-3等)，用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，以在30個(gè)循環(huán)內(nèi)有擴(kuò)增曲線、在對(duì)應(yīng)熔解溫度出現(xiàn)相應(yīng)的熔解峰為檢出標(biāo)準(zhǔn)，確定SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法檢出MA的最低模板濃度為5.6×10-2ng/μL，30個(gè)循環(huán)之后雖有擴(kuò)增曲線，但無熔解曲線。見圖3。

2.2普通PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)菌株測(cè)序結(jié)果 通用引物hsp65擴(kuò)增21種標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA，均獲得441 bp產(chǎn)物(圖4)；通用引物16S rDNA擴(kuò)增5種常見致病菌的DNA，均獲得922 bp產(chǎn)物(圖5)。21種標(biāo)準(zhǔn)菌株及5種常見致病菌的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)菌種DNA比對(duì)，其一致性均在99%以上。其中，MA的測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的AF281650.1比對(duì)，一致性達(dá)100%。

2.2.2200株臨床分離株測(cè)序結(jié)果 經(jīng)hsp65、16S rDNA擴(kuò)增及測(cè)序，共鑒定出16株MA,184株非MA，包括胞內(nèi)分枝桿菌100株、膿腫分枝桿菌30株、龜分枝桿菌2株、堪薩斯分枝桿菌10株、戈登分枝桿菌6株、副戈登分枝桿菌2株、偶發(fā)分枝桿菌2株、結(jié)核分枝桿菌24株、馬賽分枝桿菌4株、其他分枝桿菌4株(副瘰疬分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、施氏分枝桿菌、豬分枝桿菌各1株)。

2.3兩種方法鑒定臨床分離株結(jié)果的比較 200株臨床分離株經(jīng)SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)，有15株在30個(gè)循環(huán)內(nèi)擴(kuò)增曲線陽性且熔解曲線分析均顯示在87.5 ℃左右形成單一熔解峰，鑒定為MA；有185株擴(kuò)增曲線陰性，鑒定為非MA。以hsp65、16S rDNA測(cè)序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)，評(píng)估建立的SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法鑒定MA的準(zhǔn)確性。與測(cè)序結(jié)果相比，本法MA檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩法符合率為99.5%(199/200)，一致性較高，Kappa值為0.965，P<0.01；在30個(gè)循環(huán)內(nèi)，鑒定MA的敏感性為93.8%(15/16)、特異性為100.0%(184/184)、陽性預(yù)測(cè)值為100.0%(15/15)、陰性預(yù)測(cè)值為99.5%(184/185)。

3 討論

我國(guó)不同地區(qū)開展的研究均表明MAC是我國(guó)主要流行的NTM[9-10]。MA是人獸共患傳染病病原體[11]，在人類中可導(dǎo)致肺部、軟組織、兒童淋巴結(jié)、皮膚感染等[12-13]。MA感染不僅在臨床表現(xiàn)和組織病理上缺乏特異性[13]，與胞內(nèi)分枝桿菌的耐藥譜還存在明顯差異[14]。因此，MA的菌種鑒定對(duì)確定傳染源、分析傳播途徑、制定合理治療方案具有重要意義。

以生化試驗(yàn)為主的鑒定NTM的技術(shù)，因其操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、結(jié)果準(zhǔn)確率低的原因，現(xiàn)已不常使用；ELISA等血清學(xué)診斷方法用于NTM的鑒定仍處于初級(jí)階段[15]。依據(jù)鑒定原理，目前菌種鑒定的方法有2類：一類是分析分枝桿菌組成成分差異的技術(shù)，如：高效液相色譜技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)等；一類是以PCR為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)，如：PCR-DNA直接測(cè)序技術(shù)、PCR-核酸探針技術(shù)等[16]。前者由于操作復(fù)雜、分析設(shè)備價(jià)格昂貴等原因在臨床中普及受到限制。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR-DNA測(cè)序的方法為菌種鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”[16]，為彌補(bǔ)單一DNA測(cè)序鑒定分枝桿菌菌種方法的不足，常聯(lián)合hsp65和16S rDNA等2個(gè)及以上的分子標(biāo)識(shí)以提高分辨力，但因價(jià)格昂貴，難以廣泛應(yīng)用于臨床?；赟YBR Green Ⅰ熒光染料的PCR熔解曲線法相較于其他分子方法，如PCR-核酸探針技術(shù)、DNA芯片技術(shù)、PCR-指紋圖譜等，價(jià)格更低廉、操作更簡(jiǎn)便。IS1311是僅存在于MA中的特異性插入序列[17]，對(duì)MA的鑒定和分型具有較高的診斷價(jià)值，已用于多項(xiàng)流行病學(xué)研究[18-19]。因此，本研究以IS1311為基礎(chǔ)，建立基于SYBR Green Ⅰ熒光染料的鑒定MA的PCR熔解曲線方法。

IS1311是MA中含有轉(zhuǎn)座酶基因的特異性插入元件。Shin等[17]研究表明，IS1311均存在于MA的4個(gè)亞種(avium亞種、副結(jié)核亞種、silvaticum亞種和hominissuis亞種)，而與之形態(tài)和生化特性相近的胞內(nèi)分枝桿菌和其他NTM中均不存在IS1311。Chae等[7]也證實(shí)其診斷MA具有100%的準(zhǔn)確性。插入序列IS1245雖被報(bào)道有較高診斷價(jià)值，但并不存在于鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種[20]。本研究基于IS1311特異序列設(shè)計(jì)引物建立的方法在30個(gè)循環(huán)內(nèi)可準(zhǔn)確鑒定出21種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株及5種致病菌中的MA，檢測(cè)MA的檢測(cè)限為5.6×10-2ng/μL。

本研究選擇目前應(yīng)用廣泛的熒光染料SYBR Green Ⅰ建立鑒定MA的PCR熔解曲線方法，具有簡(jiǎn)單、通用性好、價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì)，更有利于在臨床實(shí)踐中推廣。值得注意的是，由于SYBR Green Ⅰ可與所有雙鏈DNA相結(jié)合，擴(kuò)增后需要進(jìn)行熔解曲線分析，從而排除引物二聚體或非特異產(chǎn)物對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響[21]。本研究在60 ℃的最佳退火溫度下，對(duì)IS1311-3擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，結(jié)果顯示為單峰(Tm值87.5 ℃)，無二聚體或非特異產(chǎn)物出現(xiàn)。

通過優(yōu)化退火溫度，IS1311-3擴(kuò)增鑒定MA標(biāo)準(zhǔn)菌株時(shí)，在30個(gè)循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線；同樣條件下鑒定除MA之外相同濃度或更高濃度的20種NTM和5種常見致病菌時(shí)，均未在30個(gè)循環(huán)前出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，同時(shí)在30個(gè)循環(huán)后出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線的樣本無相應(yīng)Tm值的熔解曲線。因此本研究選擇在30個(gè)循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線及在87.5 ℃左右出現(xiàn)相應(yīng)熔解峰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為最終判定標(biāo)準(zhǔn)，建立鑒定MA的SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法。

建立的方法在包含14種分枝桿菌的200株臨床分離株中鑒定出MA的比率與測(cè)序結(jié)果相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與測(cè)序結(jié)果的一致性較高，Kappa值>0.75，P<0.01。說明本研究中建立的SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法對(duì)MA具有較高的診斷準(zhǔn)確性。本法敏感性為93.8%，特異性為100%，陽性預(yù)測(cè)值為100%，陰性預(yù)測(cè)值為99.5%。與其他以16S rDNA、hsp65、16S-23S rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)為靶標(biāo)鑒定臨床分離株的結(jié)果(93.9%，169/180)[22]一致，與基因芯片法特異性(98.9%)相似，敏感性(80.0%)稍高[23]。SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法以DNA為檢測(cè)靶標(biāo)，更加穩(wěn)定，且IS1311在基因組中有6～8個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因拷貝[24]，與16S rDNA在活菌內(nèi)的拷貝數(shù)相當(dāng)，較高于hsp65、rpoB的拷貝數(shù)，可提高檢測(cè)的靈敏度，具有檢測(cè)臨床樣本中MA的潛力。

本研究也存在局限，建立的SYBR Green Ⅰ熒光PCR熔解曲線法在標(biāo)準(zhǔn)菌株中能很好地鑒定MA，但應(yīng)用于臨床菌株時(shí)，未能將其完全檢測(cè)出，重復(fù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)該菌的擴(kuò)增曲線始終在30～32循環(huán)之間，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger雙向測(cè)序后的序列與U16276.1比對(duì)為100%。分析其原因可能與該菌和MA標(biāo)準(zhǔn)菌的IS1311拷貝數(shù)有差異，導(dǎo)致其擴(kuò)增循環(huán)數(shù)較大有關(guān)。因此，在30個(gè)循環(huán)左右出現(xiàn)擴(kuò)增曲線及在87.5 ℃左右出現(xiàn)熔解峰的菌疑似MA，需進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。此外，目前建立的該方法僅初步用于臨床菌株的鑒定，下一步將繼續(xù)完善，從而能直接應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)。因此，未來需大樣本臨床檢測(cè)，來驗(yàn)證該方法的診斷準(zhǔn)確性。

基于SYBR Green Ⅰ建立的鑒定MA的熒光PCR熔解曲線法具有特異、敏感的優(yōu)勢(shì)，且該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，對(duì)于缺乏經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員培訓(xùn)后即可開展實(shí)驗(yàn)，更易于在臨床中推廣。