楊帥 黃穎 王志英 刁桂萍

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

林木病蟲(chóng)害給我國(guó)林業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展帶來(lái)巨大的威脅，也給我國(guó)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失。目前對(duì)林木病蟲(chóng)害的主要防治措施仍以化學(xué)防治為主?；瘜W(xué)藥劑雖然在短期內(nèi)能夠起到殺滅病蟲(chóng)害的作用，但長(zhǎng)期使用會(huì)引起抗藥性、造成環(huán)境污染，同時(shí)也會(huì)殺傷天敵、破壞生態(tài)平衡，并對(duì)人類(lèi)產(chǎn)生危害。植物蛋白酶抑制劑(PI)是一類(lèi)能夠抑制蛋白水解酶活性的小分子蛋白質(zhì)，在貯藏組織中及植物的地上部分均有表達(dá)[1]。研究證實(shí)，當(dāng)植物受到昆蟲(chóng)和病原菌侵染后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量植物蛋白酶抑制劑干擾昆蟲(chóng)的消化過(guò)程，同時(shí)蛋白酶抑制劑在植物體內(nèi)大量的積累亦能夠誘導(dǎo)其產(chǎn)生防御機(jī)制來(lái)對(duì)抗病原菌的侵入[2-4]。絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)是植物蛋白酶抑制劑中種類(lèi)最多、分布最廣，兼具抗病蟲(chóng)效果的一類(lèi)蛋白酶抑制劑[5]。早在1954年，Lipke et al.[6]就發(fā)現(xiàn)大豆中的絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)雜擬谷盜(Triboriamconfusum)表現(xiàn)出毒性。Yoo et al.[7]的研究發(fā)現(xiàn)，在桃蚜(Myzuspersicae)侵染筍瓜(Cucurbitamaxima)過(guò)程中，其韌皮部?jī)?nèi)絲氨酸蛋白酶抑制劑的質(zhì)量濃度有所增加，說(shuō)明絲氨酸蛋白酶抑制劑可能在筍瓜抵御桃蚜侵襲中起作用。雷舒[8]通過(guò)對(duì)比不同抗蟲(chóng)茶樹(shù)品種中絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達(dá)模式，認(rèn)為絲氨酸蛋白酶抑制劑在茶樹(shù)抵御昆蟲(chóng)取食中起重要作用。王裕鵬等[9]鑒定了川桑(Morusnotabilis)中的絲氨酸蛋白酶抑制劑并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了分析，認(rèn)為這些蛋白在桑樹(shù)防御昆蟲(chóng)取食的過(guò)程中起重要作用。王潔華等[10]研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)黑楊(Poplusnigra)絲氨酸蛋白酶抑制劑基因PnKTIA6的擬南芥(Arabidopsisthaliana)對(duì)小菜蛾(Plutellaxylostella)具有較高抗性。Qu et al.[11]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)絲氨酸蛋白酶抑制劑基因RBBI2-3提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)稻瘟病病原菌(Pyriculariaoryzae)的抗性。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)SPI在植物產(chǎn)生效應(yīng)器-激發(fā)的免疫性過(guò)程中起作用，但相關(guān)研究[12-14]并不深入。迄今為止，針對(duì)植物絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究主要集中在豆科(Leguminosae)、茄科(Solanaceae)以及禾本科(Poaceae)植物上[15-16]，對(duì)于木本植物絲氨酸蛋白酶的研究，特別是對(duì)于作為木本模式植物的楊樹(shù)SPI的功能研究十分稀少。本研究利用PCR技術(shù)從毛果楊(Populustrichocarpa)中分離獲得1條絲氨酸蛋白酶基因PtrSPI，將其構(gòu)建到分泌型真核表達(dá)載體pPIC9K中，并轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因畢赤酵母，誘導(dǎo)獲得重組蛋白表達(dá)，為后期獲取大量具有活性的重組毛果楊絲氨酸蛋白酶抑制劑及深入研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

毛果楊組培苗由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；真核表達(dá)載體菌株TOP10F′-pPIC9K由東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；大腸桿菌TOP10感受態(tài)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 毛果楊PtrSPI基因的克隆與序列分析

通過(guò)NCBI的ORF查找器尋找毛果楊PtrSPI基因的開(kāi)放讀碼框；利用ProtParam軟件預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；運(yùn)用BlastP對(duì)毛果楊PtrSPI基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行保守區(qū)預(yù)測(cè)及同源性搜索，選取15個(gè)與毛果楊PtrSPI基因的氨基酸序列相近的絲氨酸蛋白酶抑制劑氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)；使用Swiss-model軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)；利用ProtScale在線分析(http://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)蛋白疏水性；用MEGA5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.3 毛果楊PtrSPI基因真核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)毛果楊PtrSPI基因序列以及真核表達(dá)載體pPIC9K序列設(shè)計(jì)引物，并交由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成：Sp1，5′-ATCGGAATTCATGGATCTCCGTGACTCGATC-3′(下劃線處為EcoRI酶切位點(diǎn))；Sp2，5′-CGATGCGGCCGCATTGGCCTGTGAGGGGTCGAG-3′(下劃線處為NotI酶切位點(diǎn))。

以毛果楊cDNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI對(duì)PCR回收產(chǎn)物和質(zhì)粒pPICK進(jìn)行雙酶切，并用T4 DNA Ligase連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)中，獲得重組表達(dá)載體pPIC9K-PtrSPI。

1.4 重組表達(dá)載體pPIC9K-PtrSPI轉(zhuǎn)化畢赤酵母及其轉(zhuǎn)化子篩選

電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pPIC9K-PtrSPI轉(zhuǎn)入到畢赤酵母GS115感受態(tài)中，然后涂布于RDB平板(不加組氨酸)上，30 ℃恒溫培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行搖菌，分別取10 μL菌液點(diǎn)在含不同質(zhì)量濃度遺傳霉素(0、0.50、0.75、1.00、1.50、1.75 g·L-1)的YPD平板上培養(yǎng)，然后從含有高質(zhì)量濃度遺傳霉素G418的平板上挑取5個(gè)轉(zhuǎn)化子放入BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)后，提取轉(zhuǎn)基因畢赤酵母基因組DNA，并進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.5 真核重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將上述獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為2～6。吸取一定量菌液于100 mL BMMY培養(yǎng)基(含終質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%甲醇)中至OD600=1，置于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)24 h后取樣，使用密理博蛋白純化柱過(guò)濾除雜蛋白后用于SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，以空載體作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊PtrSPI基因全長(zhǎng)cDNA獲得與生物信息學(xué)

毛果楊PtrSPI基因的cDNA編碼區(qū)序列全長(zhǎng)為1 176 bp，共可編碼391個(gè)氨基酸(圖1)。使用ProtParam軟件預(yù)測(cè)該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為42 648.45，理論等電點(diǎn)為5.21。亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中。

NCBI的BlastP對(duì)毛果楊PtrSPI基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行保守區(qū)預(yù)測(cè)，從圖2A可知，該蛋白屬于SERPIN超家族，具有該家族的保守區(qū)結(jié)構(gòu)域。ProtScale軟件分析結(jié)果顯示(圖2B)，氨基酸殘基的疏水性(正值表明疏水，負(fù)值表明親水)平均值(GRAVY)為-0.044 08，表明該蛋白具有親水性。使用Swiss-model軟件對(duì)蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖2C所示，該蛋白具有典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的結(jié)構(gòu)特征，由8～9個(gè)α螺旋和3個(gè)β片層構(gòu)成，含有裂口區(qū)、閉合區(qū)、A-sheet區(qū)域及反應(yīng)中心環(huán)(RCL)。其中，RCL上的鉸鏈區(qū)對(duì)Serpin的構(gòu)象變化起著重要調(diào)控作用[17]。

2.2 毛果楊PtrSPI多序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

用NCBI的BlastP對(duì)PtrSPI基因進(jìn)行同源性搜索，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與毛果楊絲氨酸蛋白酶抑制劑基因PtrSPI的氨基酸序列匹配的序列共有100個(gè)，同源性為64%～92%。選取與該基因的氨基酸序列相似性較高的15個(gè)序列，進(jìn)行多序列比對(duì)(圖3)。ClustalW比對(duì)結(jié)果表明，毛果楊絲氨酸蛋白酶抑制劑基因PtrSPI的氨基酸序列與胡楊(P.euphratica)絲氨酸蛋白酶抑制劑氨基酸序列XP_011030699同源性最高，達(dá)到92%，且這16個(gè)氨基酸序列C端均含有高度保守的RCL氨基酸序列，其P12-P9為保守的氨基酸序列AAAA，P14位點(diǎn)為T(mén)，P15位點(diǎn)為G。

將毛果楊PtrSPI基因的氨基酸序列與其他15條絲氨酸蛋白酶抑制劑氨基酸序列用MEGA5.0進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。16條序列被分為6個(gè)分支，其中毛果楊絲氨酸蛋白酶抑制劑氨基酸序列與胡楊絲氨酸蛋白酶抑制劑氨基酸序列親緣關(guān)系最近，并與2個(gè)橡膠樹(shù)絲氨酸蛋白酶抑制劑氨基酸序列(XP_021648006和XP_021642770)共同位于第1分支。此外，柑橘屬植物中的絲氨酸蛋白酶抑制劑均位于第3分支，親緣關(guān)系較近。

2.3 毛果楊PtrSPI基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

對(duì)已構(gòu)建的毛果楊PtrSPI基因真核表達(dá)載體進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。從圖5可見(jiàn)，在1176bp左右出現(xiàn)了特異條帶，初步證明目的基因已與真核載體pPIC9K連接成功。將PCR檢測(cè)成功的菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明真核重組載體構(gòu)建成功。

*表示同源。XP_006375008為毛果楊(Populustrichocarpa)；XP_011030699為胡楊(P.euphratica)；XP_021648006為橡膠(Heveabrasiliensis)；XP_012071718為麻風(fēng)樹(shù)(Jatrophacurcas)；XP_021642770為橡膠；XP_007017373為可可樹(shù)(Theobromacacao)；XP_010059775為巨桉(Eucalyptusgrandis)；XP_009364054為梨(Pyrus×bretschneideri)；XP_010089933為蘋(píng)果(Morusnotabilis)；XP_023906656為歐洲栓皮櫟(Quercussuber)；XP_021820930為櫻桃(Prunusavium)；XP_008378534為苜蓿(Malusdomestica)；PSS17234為中華獼猴桃(Actinidiachinensisvar.chinensis)；XP_006473392為甜柳橙(Citrussinensis)；XP_006434870為柑橘(C.clementina)；GAY39438為蜜柑(C.unshiu)。

圖3毛果楊PtrSPI蛋白多序列比對(duì)

2.4 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定

從不含組氨酸的RDB培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子，將其分別接種到含有不同終質(zhì)量濃度遺傳霉素G418的YPD培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，對(duì)照為未轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株。由圖6可知，在含有終質(zhì)量濃度為0、0.50、0.75 g·L-1G418的YPD平板上只有少數(shù)轉(zhuǎn)化子不生長(zhǎng)，含終質(zhì)量濃度為1.0、1.5 g·L-1G418的YPD平板上只有一小部分轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)，而在終質(zhì)量濃度為1.75 g·L-1G418的YPD平板上幾乎無(wú)轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)。

在含終質(zhì)量濃度為1.50 g·L-1G418的YPD平板上隨機(jī)挑取5個(gè)單菌落，搖菌后提取酵母基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR結(jié)果顯示(圖7)，在1 628 bp處擴(kuò)增出特異條帶(包括載體長(zhǎng)度452 bp)，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組質(zhì)粒pPIC9K-PtSPI已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115中。

2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

畢赤酵母重組轉(zhuǎn)化菌株GS115-PtrSPI用甲醇誘導(dǎo)24 h后，收集菌液離心后取上清液，使用密理博蛋白純化柱去除雜蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。由圖8可見(jiàn)，電泳結(jié)果顯示在42 648.45處檢測(cè)到特異蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。而在對(duì)照轉(zhuǎn)化菌株中無(wú)此條帶。說(shuō)明毛果楊PtrSPI基因成功整合到畢赤酵母基因組中，并順利表達(dá)。

A.G418終質(zhì)量濃度為0；B.G418終質(zhì)量濃度為0.50 g·L-1；C.G418終質(zhì)量濃度為0.75 g·L-1；D.G418終質(zhì)量濃度為1.00 g·L-1；E.G418終質(zhì)量濃度為1.50 g·L-1；F.G418終質(zhì)量濃度為1.75 g·L-1。

圖6酵母轉(zhuǎn)化子的篩選

1.誘導(dǎo)24 h酵母轉(zhuǎn)化子GS115-PtrSPI；2.誘導(dǎo)24 h的對(duì)照轉(zhuǎn)化子GS115-pPIC9K；M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖8畢赤酵母重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

3 結(jié)論與討論

植物絲氨酸蛋白酶抑制劑能夠在植物抵御病蟲(chóng)害中起重要作用，但是對(duì)于其誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的機(jī)制尚不清楚。直接從植物體中分離獲取大量天然的PtrSPI蛋白研究其功能十分困難且繁瑣，需經(jīng)過(guò)抽提、去雜蛋白、鹽析及層析等多個(gè)過(guò)程[18]，因此通過(guò)基因工程技術(shù)獲得大量重組SPI蛋白是研究其功能的前提。

目前而言，獲取重組蛋白的方式主要有2種。一是利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)。該方式的優(yōu)勢(shì)在于重組菌株構(gòu)建容易，重組蛋白產(chǎn)量高，發(fā)酵條件經(jīng)濟(jì)可控，缺點(diǎn)則是重組蛋白往往形成無(wú)活性的包涵體，必須經(jīng)過(guò)復(fù)性后才能后續(xù)應(yīng)用。杜霸[19]使用原核表達(dá)體系對(duì)水稻絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白OsSerpin進(jìn)行了異源表達(dá)，并通過(guò)對(duì)重組蛋白的變性、復(fù)性及分離純化等過(guò)程后仍未獲得具有活性的重組蛋白。二是利用酵母進(jìn)行的真核表達(dá)系統(tǒng)。其優(yōu)勢(shì)在于重組蛋白表達(dá)量高、分泌效率高、雜蛋白含量少。張燕青[20]使用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)大豆絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白S2T1進(jìn)行了異源表達(dá)，通過(guò)對(duì)分離純化獲得的重組蛋白功能進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)其對(duì)胰蛋白酶及枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis)均有較強(qiáng)的抑制作用?？梢?jiàn)，使用真核表達(dá)系統(tǒng)能夠更高效的獲得具有活性的絲氨酸蛋白酶抑制劑。本研究克隆了毛果楊絲氨酸蛋白酶抑制劑基因PtrSPI，并通過(guò)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功獲取了毛果楊絲氨酸蛋白酶抑制劑PtrSPI重組蛋白，為后續(xù)分離純化并研究該蛋白功能奠定基礎(chǔ)。