王麗 毛鑫 譙天敏 朱天輝 李姝江

(四川農業(yè)大學，溫江，611130)

核桃(Juglansregia)主要分布在東亞、中亞、西亞、南亞、歐洲和美國等地[1]，是世界重要的油料樹種。我國核桃種植資源豐富，種植范圍極廣，黑龍江、遼寧、湖北、陜西、云南、四川等22省市均有分布，其主要產區(qū)在四川、云南、陜西等省。核桃含豐富的不飽和脂肪酸及鋅、鉀、鐵、維生素、泛酸等營養(yǎng)物質，具有溫肺定喘、潤腸通便的功效[2-3]。隨著核桃種植面積的增加，核桃病蟲害的發(fā)生越來越頻繁[4-5]。經研究報道顯示，在河北、山東、山西、遼寧、河南、江蘇、浙江、四川、云南、山西、甘肅等省核桃產區(qū)核桃病蟲害發(fā)病嚴重[6-7]。核桃黑斑病是核桃生產中的主要病害之一，對核桃的葉、芽、枝和果實都有一定的危害[8]。目前，對核桃黑斑病的研究主要集中在病原菌分離、發(fā)生特點、防治措施等方面[4-6]，對核桃黃單胞桿菌(Xanthomonascampestris)胞外多糖致病性的研究較少，因而關于致病細菌胞外多糖對核桃黑斑病有何作用是值得探索和研究的一個問題。本研究利用分離鑒定出的核桃黃單胞桿菌為試驗菌株，進行胞外多糖的提取。將提取出的粗多糖配制成不同質量濃度，分別作用于健康和感病的核桃植株上，觀察其發(fā)病規(guī)律，測定其對核桃生理代謝的影響，從而確定胞外多糖對核桃黑斑病的影響，探究其致病機理。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

核桃黑斑病病原菌黃單胞桿菌由四川農業(yè)大學林木病理實驗室分離并保存。菌株活化及振蕩培養(yǎng)采用NA固體培養(yǎng)基(蛋白胨5～10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH調到7.0)及NA液體培養(yǎng)基(蛋白胨5～10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 L，pH調到7.0)。胞外粗多糖制備采用發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉40.00 g，蛋白胨2.00 g，碳酸鈣3.00 g，磷酸氫二鉀5.00 g，硫酸鎂0.50 g，硫酸亞鐵0.25 g，檸檬酸0.25 g，蒸餾水定容至1 L，pH調節(jié)至7.0)。

1.2 胞外粗多糖的制備

將黃單胞桿菌接種于NA平板上活化12 h，挑取單菌落接種至裝有50 mL NA培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)36 h，收集菌液按體積分數1%比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)72 h。收集發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心15 min，取上清液加入3倍體積的體積分數95%乙醇，4 ℃靜置12 h，低溫冷凍離心，收集沉淀，干燥后再次溶解于蒸餾水中，加入1/4體積的Sevag試劑，混合后劇烈震蕩20 min，分層除去下層有機相，上層液體，10 000 r·min-1離心15 min，除去變性蛋白質，脫蛋白重復2～3次，在無蛋白沉淀溶液中加入超過2倍體積的體積分數95%乙醇，靜置4 h后，傾倒部分上清液，余下混合液于10 000 r·min-1離心15 min，棄上清液，收集多糖沉淀，烘干備用。

1.3 胞外粗多糖致病性檢測

采用針刺法，取生長良好、健康的核桃葉片，消毒處理后分別噴施1.5、3.0、5.0 g·L-1的胞外粗多糖溶液于葉片表面，每2 h噴施1次，共3次，以清水處理作為空白對照，每處理設3個重復。處理葉片置于培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)3 d，觀察并記錄葉片的發(fā)病癥狀。

1.4 胞外粗多糖處理后核桃葉片生理指標測定

采用盆栽試驗，用蒸餾水配制質量濃度為0.5、1.5、3.0、5.0 g·L-1的胞外多糖溶液，分別對長勢相同的核桃苗進行噴施，并以清水作為對照(CK1)。每個質量濃度處理5株核桃苗，重復3次。同時，選取2組生長基本保持一致的核桃植株分別接種黃單胞桿菌。接種24 h后，處理組分別噴施質量濃度為0.5、1.5、3.0、5.0 g·L-1的胞外多糖溶液，另一組作為空白對照(CK2)。噴施胞外多糖溶液后0、1、3、5、7 d分別采集核桃葉片測定相關生理指標，每個指標重復3次。電導率測定使用DDS-11A型直讀式電導儀：相對電導率=處理電導率/煮沸電導率×100%；丙二醛(MDA)質量摩爾濃度測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法；游離脯氨酸質量分數測定采用茚三酮顯色法；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)光還原法；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚氧化法[9]。

1.5 數據分析與處理

應用Excel 2010和SPSS 20.0分析處理試驗數據并制圖。采用單因素方差分析和最小顯著性差異(LSD)分析各組數據的差異性。

2 結果與分析

2.1 胞外粗多糖的致病性

培養(yǎng)3 d后，對照組的核桃葉片生長良好，噴施不同質量濃度胞外多糖的核桃葉片，出現病斑、萎焉癥狀。胞外多糖質量濃度為0.5 g·L-1時，核桃葉片表面出現零星病斑，隨著處理質量濃度的增加，葉片表面的病斑開始擴大且蔓延。當質量濃度為5.0 g·L-1時，病斑面積覆蓋整個葉片的80%左右，葉片出現枯黃萎焉等癥狀(圖1)?？梢?，將胞外多糖作用于核桃葉片，會使葉片表現相應癥狀，隨著質量濃度的增加，其癥狀也呈現加重趨勢。

2.2 胞外粗多糖對核桃葉片細胞膜透性的影響

由表1可見，處理后3～7 d，健康植株和感病植株各處理組葉片細胞的電導率隨處理質量濃度增加而增高，不同質量濃度梯度的電導率也隨著處理時間的增加而呈上升趨勢，并顯著高于對照組(CK1)，表現出葉片細胞電導率同處理時間、處理質量濃度呈正相關關系，表明噴施胞外多糖會對核桃葉片細胞的膜系統(tǒng)造成損傷。相比于健康植株處理組，感病植株在同一處理水平的電導率更高，細胞膜受損傷程度更大，對照組(CK2)的電導率也有一定程度的提高，但這是由于細胞內和細胞外水勢差異的影響造成的，與其他質量濃度處理組相比上升幅度不大。

2.3 胞外粗多糖對核桃葉片MDA質量摩爾濃度的影響

由表2可見，用胞外多糖溶液處理健康核桃和感病核桃后，葉片中MDA質量摩爾濃度均明顯高于對照，表明胞外多糖溶液處理的核桃細胞膜脂過氧化水平和膜損傷程度較高。相同處理時間，MDA質量摩爾濃度隨處理質量濃度增加而升高。在處理前5 d內，隨處理時間延長，MDA質量摩爾濃度增加，二者呈正相關關系，到第7天，其質量摩爾濃度較第5天有所下降，但仍顯著高于對照組。健康核桃和感病核桃的MDA質量摩爾濃度均在5.0 g·L-1處理5 d時最高，但感病核桃葉片MDA質量摩爾濃度高于健康核桃且上升更快。

表1 黃單胞桿菌胞外多糖對核桃葉片細胞電導率的影響

處理時間/d接種后葉片細胞電導率/%CK2胞外多糖0.5g·L-1胞外多糖1.5g·L-1胞外多糖3.0g·L-1胞外多糖5.0g·L-10(10.15±0.36)a(10.27±0.86)a(9.85±0.96)a(10.65±0.62)a(10.52±0.58)a1(12.93±0.24)b(14.55±0.77)b(15.09±0.60)b(16.85±0.85)ab(18.27±1.22)a3(24.57±0.88)e(30.75±1.15)d(36.74±0.93)c(40.96±1.02)b(44.75±1.10)a5(30.91±1.08)e(38.67±0.72)d(45.52±0.80)c(49.39±1.20)b(55.97±0.97)a7(34.07±0.89)d(45.62±0.82)c(52.97±2.03)b(57.82±1.44)b(65.45±3.55)a

注：表中數據為平均值±標準誤，數據后同列不同小寫字母表示不同時間處理間差異顯著(P<0.05)。

表2 黃單胞桿菌胞外多糖對核桃葉片細胞MDA質量摩爾濃度的影響

處理時間/d接種后葉片細胞MDA質量摩爾濃度/μmol·g-1CK2胞外多糖0.5g·L-1胞外多糖1.5g·L-1胞外多糖3.0g·L-1胞外多糖5.0g·L-10(0.013±0.002)a(0.014±0.001)a(0.015±0.001)a(0.014±0.003)a(0.015±0.002)a1(0.018±0.003)a(0.022±0.002)a(0.021±0.002)a(0.022±0.002)a(0.023±0.002)a3(0.024±0.002)c(0.032±0.002)b(0.041±0.003)a(0.045±0.002)a(0.047±0.002)a5(0.035±0.002)c(0.047±0.002)b(0.053±0.002)b(0.059±0.004)ab(0.063±0.002)a7(0.041±0.003)c(0.045±0.004)bc(0.049±0.001)b(0.056±0.002)ab(0.058±0.002)a

注：表中數據為平均值±標準誤，數據后同列不同小寫字母表示不同時間處理間差異顯著(P<0.05)。

2.4 胞外粗多糖對核桃葉片游離脯氨酸質量分數的影響

由表3可見，不同質量濃度胞外多糖溶液處理核桃葉片后，各組游離脯氨酸質量分數呈上升趨勢，且均高于對照。同一水平上，在0.5～3.0 g·L-1時，游離脯氨酸質量分數隨胞外粗多糖質量濃度上升而增加，兩處理組均在質量濃度為3.0 g·L-1、處理7 d時，葉片細胞脯氨酸質量分數達到峰值，感病核桃高于健康核桃。當質量濃度提高到5.0 g·L-1時，兩處理組游離脯氨酸質量分數開始下降，這說明在核桃可以忍受的胞外多糖質量濃度范圍內，游離脯氨酸質量分數有一定程度的增加，但超過了這個質量濃度范圍，由于細胞器溶解等生理生化反應，核桃可能失去原有的組織功能，導致游離脯氨酸質量分數急劇下降。

2.5 胞外粗多糖對核桃葉片SOD酶活性的影響

由表4可見，不同質量濃度胞外多糖溶液處理后，核桃葉片中的SOD活性較對照顯著上升，處理0～5 d，活性隨處理時間增加而升高，第5天后開始下降。不同質量濃度的胞外多糖溶液與對照組相比，SOD活性差異顯著。同一時間段，在質量濃度為0.5～3.0 g·L-1時，SOD活性隨胞外粗多糖質量濃度上升而增加，質量濃度為3.0 g·L-1、處理5 d時，2個處理組細胞中SOD活性達最大值，分別為457.13、507.18 U·g-1，較相同處理時間內對照組高103.07%、38.05%。當胞外多糖溶液質量濃度增加到5.0 g·L-1時，SOD活性逐漸降低，表明核桃葉片中的SOD活性和抗病性隨病害嚴重程度的增加而增加，但當胞外多糖質量濃度過高時，SOD酶系統(tǒng)失去功能，會使酶損傷，導致其活性降低。

2.6 胞外粗多糖對核桃葉片POD酶活性的影響

由表5可知，不同質量濃度胞外粗多糖處理下，各處理組細胞內POD活性均顯著高于對照組。同一質量濃度作用下，隨著處理時間的增加，POD活性呈先上升再下降的趨勢。相同處理時間內，當質量濃度從0.5 g·L-1增加到3.0 g·L-1時，細胞內POD活性隨著質量濃度的增加而上升，但當處理質量濃度增加到5.0 g·L-1L時，POD活性開始下降。質量濃度為3.0 g·L-1、處理5d時，葉片中POD活性達到峰值，分別為684.359、756.18 U·g-1，比對照組高217.26%、40.88%。這表明核桃葉片在發(fā)病過程中生理活動旺盛，具有一定的抗性，但當胞外多糖質量濃度達到相應閾值后，POD活性不再提高反而下降，說明植物的機體組織可能已經遭到破壞。

表3 黃單胞桿菌胞外多糖對核桃葉片細胞游離脯氨酸質量分數的影響

處理時間/d接種后葉片細胞游離脯氨酸質量分數/μg·g-1CK2胞外多糖0.5g·L-1胞外多糖1.5g·L-1胞外多糖3.0g·L-1胞外多糖5.0g·L-10(38.517±0.73)a(38.917±0.94)a(38.956±0.20)a(39.072±0.80)a(39.437±1.28)a1(41.072±0.79)d(44.163±1.16)c(48.812±0.73)b(54.082±0.89)a(45.917±1.03)bc3(49.514±1.25)d(55.379±1.32)c(60.817±0.74)b(65.179±0.96)a(57.862±1.05)bc5(54.816±0.52)d(60.763±1.06)d(75.516±1.40)b(81.327±1.33)a(65.265±1.60)c7(65.356±0.37)d(72.516±0.77)c(83.916±0.43)b(89.056±1.13)a(72.316±1.12)c

注：表中數據為平均值±標準誤，數據后同列不同小寫字母表示不同時間處理間差異顯著(P<0.05)。

表4 黃單胞桿菌胞外多糖對核桃葉片細胞SOD活性的影響

處理時間/d接種后葉片細胞SOD活性/U·g-1CK2胞外多糖0.5g·L-1胞外多糖1.5g·L-1胞外多糖3.0g·L-1胞外多糖5.0g·L-10(192.108±7.23)a(194.375±6.37)a(197.714±12.86)a(198.923±4.37)a(198.834±9.22)a1(230.572±10.25)a(237.654±6.48)a(240.953±7.63)a(242.075±4.10)a(244.919±7.72)a3(321.751±4.45)c(374.105±4.25)b(389.517±7.32)ab(400.172±5.05)a(380.246±5.16)b5(396.092±6.61)d(429.216±7.37)c(486.649±4.83)b(507.178±5.74)a(491.627±5.44)ab7(347.075±14.17)c(390.374±8.09)b(417.517±5.00)a(426.167±6.20)a(409.972±5.75)ab

注：表中數據為平均值±標準誤，數據后同列不同小寫字母表示不同時間處理間差異顯著(P<0.05)。

表5 黃單胞桿菌胞外多糖對核桃葉片細胞POD活性的影響

處理時間/d接種后葉片細胞POD活性/U·g-1CK2胞外多糖0.5g·L-1胞外多糖1.5g·L-1胞外多糖3.0g·L-1胞外多糖5.0g·L-10(213.758±2.57)a(209.756±4.16)a(215.357±5.22)a(218.627±5.91)a(207.568±1.65)a1(309.857±2.93)b(317.654±5.69)b(336.859±3.64)a(348.516±3.85)a(339.862±3.87)a3(457.821±3.47)e(497.268±9.01)d(518.273±4.50)c(617.821±5.42)a(557.864±4.79)b5(536.743±3.61)d(619.743±4.46)c(665.382±3.82)b(756.175±5.94)a(676.168±4.80)b7(413.768±3.10)d(457.856±4.99)c(500.965±9.62)b(605.863±3.91)a(518.236±5.14)b

注：表中數據為平均值±標準誤，數據后同列不同小寫字母表示不同時間處理間差異顯著(P<0.05)。

3 結論與討論

植物病原細菌產生的胞外多糖屬于次級代謝產物，相關研究表明，胞外多糖是重要的致病因子，對病害的發(fā)生起著重要作用，可以對寄主的生理生化代謝、酶系統(tǒng)活性及核酸代謝等產生顯著地影響[10-13]。本研究用胞外多糖溶液分別處理健康和感病的核桃葉片，通過分析相關生理生化指標，從而確定了其致病性。

本研究中，用胞外粗多糖溶液處理后，核桃葉片的細胞膜系統(tǒng)受損傷，導致透性改變、電解質外滲、電導率增加，且細胞中MDA質量摩爾濃度上升，這與張婷等[14]、李小琴等[15]的研究結果一致。此外，接種黑斑病的核桃葉片經胞外多糖溶液處理后，其電導率及MDA質量摩爾濃度增長較對照組更快，證明胞外多糖溶液加速了細胞電解質外滲，提高了電導率，導致細胞膜損傷加重。在逆境脅迫下，大多數植物均會積累大量的脯氨酸，以適應在逆境條件下植物細胞內外滲透壓的變化，使植物具有一定的抗性和保護作用[16-18]。本研究結果顯示，經過胞外粗多糖溶液處理游離脯氨酸質量分數上升，表明核桃葉片具有一定的抗脅迫能力。該結果同王勇等[19-21]研究結果一致。本研究所提取的黃單胞桿菌胞外粗多糖尚未純化為單一多糖，除單一多糖外還含有蛋白等成分。據前人研究結果推測粗多糖提取液中主要致病因子為多糖成分[22]，此推測有待進一步分離純化胞外粗多糖成分后進行驗證。

綜上，核桃黃單胞桿菌胞外多糖質量濃度在一定程度上能夠影響核桃機體的正常生理指標，從而揭示了胞外多糖具有致病性，這同李群良、陳小強等人的研究[32-33]相符。但其確切的致病因子及成分還有待研究和驗證。