楊晨 李厚華 朱佳賓 韓美玲 申婷 孟佳欣

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊陵，712100)

牡丹(Paeoniasuffruticosa)作為中國十大傳統(tǒng)名花之一，栽培歷史悠久，有紅、粉、紫、白、黃、黑、綠、藍(lán)和復(fù)色九大色系[1]。增加花色的多樣性是觀賞植物的重要育種目標(biāo)，牡丹的花色雖然豐富，但少有變色品種?！P丹’牡丹在開花過程中存在著花色變化的現(xiàn)象，花的顏色由紫紅色逐漸變白，這增加了‘鳳丹’花的觀賞價值?；ㄉ男纬芍饕艿交ㄉ胤N類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響[2]，決定牡丹花呈色的色素是類黃酮化合物[1]。花青苷作為最重要的類黃酮化合物之一，是影響許多植物花色形成的關(guān)鍵性物質(zhì)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)與花色變化密切相關(guān)[3-4]。

花青苷的生物合成和積累受一系列結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的調(diào)控[5]。結(jié)構(gòu)基因主要包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查耳酮合成酶基因(CHS)、查耳酮異構(gòu)酶基因(CHI)、黃烷酮羥化酶基因(F3H)、類黃酮羥化酶基因(F3’H)、二氫黃酮醇還原酶基因(DFR)和花青素合成酶基因(ANS)。調(diào)節(jié)基因(轉(zhuǎn)錄因子基因)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，與花青苷合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要包括MYB、bHLH和WD40三大類[6]，它們通常以復(fù)合物的形式調(diào)節(jié)花青苷生物合成中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。在牡丹中，已有與花青苷合成相關(guān)的基因，如PsCHS1、PsCHI1、PsDFR1、PsMYB114L和PsMYB12L被克隆，并進(jìn)行了功能驗(yàn)證[7-10]。

現(xiàn)在關(guān)于植物花色變化的研究，大多是分析了開花過程中花的色素組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)，例如，對芍藥(Paeonialactiflora)、迎紅杜鵑(RhododendronmucronulatumTurcz)、臘梅(ChimonanthuspraecoxLink)開花過程中花色變化的研究，普遍認(rèn)為花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與花色變化密切相關(guān)[11-13]。Guo et al.[14]對利用轉(zhuǎn)錄組測序分析了芍藥‘Coral Sunset’花色變化過程中與花青苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與轉(zhuǎn)錄因子，總體而言，目前在分子層面上對花色變化的研究還較少。本研究以紫紅色‘鳳丹’花(Paeoniaostii‘feng dan’)為材料，通過對5個不同開花時期花瓣的色素成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)和花青苷合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，初步探討了‘鳳丹’牡丹開花過程中花色變化的原因，為深入研究牡丹花色變化的分子機(jī)理及花色育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

‘鳳丹’牡丹花取自西北農(nóng)林科技大學(xué)牡丹種質(zhì)資源圃。選取生長健壯，長勢一致，花蕾較多的植株，采集破綻期(S1)、初開期(S2)、盛開期(S3)、盛開末期(S4)、謝花期(S5)共5個開花時期的花瓣(圖1)。用液氮速凍后，放入冰箱-80 ℃保存待用。

1.2 花色表型測定

使用色彩色差儀(CR-400，Japan)測量每個時期花瓣內(nèi)表面除色斑外中央部分的明度L*值、色相a*和b*值。根據(jù)公式C*=(a*2+b*2)1/2計算彩度C*值。每個時期花瓣測量3朵花，每朵花測量3次。

1.3 色素提取

分別取適量不同時期新鮮花瓣，用液氮冷凍研磨成粉末，稱取0.3 g粉末加入4 mL甲醇于冰箱內(nèi)4 ℃遮光萃取48 h。以4 000 r·min-1離心10 min，取上層上清液，用孔徑0.22 μm的過濾器過濾后用于色素測定。

1.4 色素定性定量分析

通過高效液相色譜-二極管陣列檢測法(HPLC-DAD)對色素進(jìn)行定性和定量分析[15]。使用日本島津LC-2030C 3D高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。設(shè)置儀器參數(shù)：柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10.0 μL，流速0.50 mL·min-1，190～700 nm全波長掃描吸收光譜。流動相參數(shù)：A為體積分?jǐn)?shù)為0.04%的甲酸水溶液，B為色譜級乙腈。梯度洗脫程序：0 min，95%A，5%B；40 min，60%A，40%B；45 min，0%A，100%B；70 min，95%A，5%B；分析時間80 min。用甲醇溶解色素標(biāo)準(zhǔn)品，配制成500、250、100、75、50、10 mg·L-16種質(zhì)量濃度，根據(jù)HPLC結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個時期花瓣測定3次重復(fù)，樣品結(jié)果通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間及紫外吸收峰對比進(jìn)行定性分析，質(zhì)量分?jǐn)?shù)根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。

1.5 qRT-PCR分析花色相關(guān)基因表達(dá)

使用Omega試劑盒提取不同發(fā)育階段花瓣總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TAKARA，大連)合成第一鏈cDNA。試驗(yàn)所選的轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)已報道的對牡丹花青苷合成較為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行選擇[16]。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，所測基因引物參考Zhang et al.[16]、Zhao et al.[17]、Gao et al.[18]設(shè)計，引物序列見表1。按照試劑盒2×Plus SYBR real-time PCR mixture(Biotake，北京)說明書，采用SYBR Green法在Applied Biosystems StepOne Plus實(shí)時定量PCR儀(Applied，USA)上進(jìn)行操作。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。每個時期樣品重復(fù)3次，采用2-△△Ct法計算基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

使用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖，使用IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行方差和相關(guān)性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘鳳丹’牡丹開花過程中花色變化

‘鳳丹’從破綻期到盛開期花色為紫紅色，盛開之后花色逐漸變淺，到謝花期花瓣基本變白(圖1)。經(jīng)過花色表型測定之后發(fā)現(xiàn)，紅綠屬性a*值和花瓣彩度C*值隨著花的開放呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，a*值在各個時期差異顯著，C*值前兩個時期差異不顯著，后3個時期差異顯著。從破綻期到盛開期a*和C*值降低較少，而從盛開期到謝花期降幅較大，紅色減弱，彩度降低，這與‘鳳丹’花從紫紅色變白過程表現(xiàn)一致。明度值L*從破綻期到謝花期逐漸升高，即在花色變化過程中花的明度隨之增強(qiáng)(表2)。

表2 ‘鳳丹’牡丹開花過程中不同時期花色參數(shù)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；b*值由負(fù)到正，代表藍(lán)色減退，黃色增強(qiáng);同列不同小寫字母表示Duncan’s檢驗(yàn)在P=0.05下差異顯著。

2.2 ‘鳳丹’牡丹花瓣色素定性和定量分析

‘鳳丹’花瓣的HPLC結(jié)果表明，花中含有芍藥花素-3,5-二葡糖苷(Pn3G5G)和矢車菊素-3，5-二葡糖苷(Cy3G5G)兩種花青苷(表3)。Pn3G5G和Cy3G5G的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在花開放過程中呈現(xiàn)下降趨勢，且S3到S5時期花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅減少。Pn3G5G在各個時期的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占相應(yīng)時期總花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的95%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Cy3G5G，是‘鳳丹’花的主要花青苷?？偦ㄇ嘬召|(zhì)量分?jǐn)?shù)從S1到S5時期一直下降，S5時期較S1時期質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低了84.11%。

此外，還檢測出了芹菜素、山奈酚、金圣草黃素、槲皮素、木犀草素、兒茶素、對香豆酸和柚皮素共8種單體酚。除金圣草黃素和對香豆酸外，其他單體酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在S1時期最高。芹菜素、山奈酚和柚皮素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先下降后上升趨勢，從S1到S4時期逐漸減少，S5時期質(zhì)量分?jǐn)?shù)少量上升。金圣草黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在花開放過程中逐漸升高，但是質(zhì)量分?jǐn)?shù)一直處于較低水平。兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)也較低，S1到S3時期質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，花開放后期質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸回升。對香豆酸在盛開后質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，但5個時期的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著差異。槲皮素、木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著花的開放而逐漸減少。芹菜素、槲皮素和柚皮素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終高于其他單體酚(表3)。

根據(jù)HPLC結(jié)果，計算得到各個時期的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢一致，呈下降趨勢。S5時期總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較S1時期下降了64.61%。

表3 ‘鳳丹’牡丹不同開花時期花瓣中類黃酮成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示Duncan’s檢驗(yàn)在P=0.05下差異顯著。

2.3 不同開花時期花青苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)分析

通過熒光定量PCR對‘鳳丹’5個開花時期的花青苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、FLS、DFR和ANS的表達(dá)量進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，CHS、CHI、F3’H、FLS基因的表達(dá)模式均為先上升再下降，并在S5時期表達(dá)量最低，除CHI基因外其他基因的表達(dá)量均顯著低于前4個時期(表4)。CHS和CHI基因在S4時期表達(dá)量最高，而F3’H和FLS基因在S2時期表達(dá)量達(dá)到最大值。F3H基因的表達(dá)模式規(guī)律不明顯，表達(dá)量先升高后下降，又升高再下降，表達(dá)量與總花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)(圖2)。PAL、DFR和ANS基因的相對表達(dá)量隨著花的不斷開放而逐漸降低，這與總花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢一致，且呈極顯著正相關(guān)(圖2)。DFR和ANS在S1時期的表達(dá)量分別是S5時期的259.18、68.14倍，相比較于其他基因大量表達(dá)。推測下游結(jié)構(gòu)基因DFR和ANS對‘鳳丹’花青苷的合成起著重要作用。

2.4 不同開花時期花青苷合成相關(guān)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)分析

采用qRT-PCR法測定了MYB22、bHLH1和WD40-1在不同開放時期‘鳳丹’花中的表達(dá)量。WD40-1的相對表達(dá)量從S1時期到S3時期不斷上升，接著逐漸降低，在S5時期質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低(表4)。WD40-1與大部分結(jié)構(gòu)基因在不同開花時期的表達(dá)量呈正相關(guān)(圖2)。MYB22和bHLH1從S1到S5時期表達(dá)量呈下降趨勢(表4)，這與總花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)構(gòu)基因PAL、DFR、ANS的表達(dá)量變化趨勢一致，且均呈極顯著正相關(guān)。MYB22和bHLH1兩者之間的表達(dá)量也呈極顯著正相關(guān)(圖2)。

表4 ‘鳳丹’牡丹不同開花時期花青苷合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示Duncan’s檢驗(yàn)在P=0.05下差異顯著。

3 結(jié)論與討論

類黃酮是高等植物花瓣呈色過程中重要的次生代謝物質(zhì)，其中花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響花色的主要因素[19-22]。通過對‘鳳丹’5個開花階段的花瓣色素組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，總花青苷和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低與花色變化有關(guān)，尤其是總花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著減少，是花色由紫紅色向白色方向變化的主要原因。在其他植物中也有類似的結(jié)果。在鴛鴦茉莉(BrunfelsiaacuminataBenth.)中花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少造成了花瓣由深紫色漸變?yōu)榘咨玔23]。Guo et al.[14]認(rèn)為兩種芍藥花色變化與花青苷和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)，花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的減少是其從珊瑚色變?yōu)辄S色的主要原因。楊琴等[15]分析了‘金衣花臉’和‘霞光’這兩個牡丹品種花瓣色素，他們認(rèn)為花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的急劇減少可能是導(dǎo)致花色由紅向黃色變化的主要因素。

花青苷生物合成的結(jié)構(gòu)基因分為早期生物合成基因(early biosynthetic genes，EBGs)和晚期的生物合成基因(late biosynthetic genes，LBGs)，EBGs位于花青苷生物合成途徑的上游，包括CHS，CHI，F(xiàn)3H等基因，負(fù)責(zé)編碼黃酮、黃酮醇等類黃酮合成的酶，而LBGs包括DFR和ANS等花青苷生物合成的下游基因，主要編碼合成花青苷的酶[24]?！P丹’花中CHS和CHI這兩個基因的表達(dá)量先逐漸增加到S4，達(dá)最大值，再下降。紅色芍藥‘Hongyanzhenghui’花在開放過程中CHS和CHI基因呈現(xiàn)類似的表達(dá)模式，表達(dá)量都在盛開后達(dá)到最大，謝花期減少[26]。F3H基因表達(dá)量呈現(xiàn)兩升三降變化趨勢，與總花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)一直下降的趨勢不一致，其表達(dá)量與總花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，可能與F3H是花青苷合成途徑上游基因，除參與花青苷合成外還參與其他的類黃酮合成有關(guān)[25，27]。DFR、ANS基因是花青苷合成的下游基因，DFR催化二氫黃酮醇形成不穩(wěn)定的無色花青素，ANS將無色花青素催化成有色花青素[27]?！P丹’花發(fā)育過程中，花青苷合成結(jié)構(gòu)基因中只有PAL、DFR、ANS基因的表達(dá)量與花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢一致，且呈極顯著正相關(guān)。PAL和ANS基因的表達(dá)模式與Wu等[28]的對雙色芍藥花的研究類似，都呈下降趨勢，且與花中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少相關(guān)。在芍藥‘Coral Sunset’花色變化研究中認(rèn)為PlF3’H、PlFLS、PlDFR、PlANS和PlUFGT結(jié)構(gòu)基因在開花前期的高表達(dá)促進(jìn)了花青苷合成，而后幾個時期表達(dá)量逐漸減少導(dǎo)致了花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著減少，造成花色變化[14]。在紅色玫瑰(Rosarugosa)花中，RrDFR、RrANS高度表達(dá)導(dǎo)致了花青苷大量積累[29]。菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)花色變化中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因包括CHS、CHI、DFR和ANS等[30]。由此推測，PAL、DFR、ANS基因?qū)ΑP丹’花發(fā)育過程中花青苷合成起重要作用。

轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH和WD40可通過調(diào)節(jié)花青苷生物合成途徑中不同結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平，從而調(diào)控花青苷的合成與積累[31-33]。研究中，MYB22的表達(dá)量與基因DFR和ANS的表達(dá)量和花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢一致，且呈極顯著正相關(guān)。近年來，對三色龍膽(Gentianatricolor)、裂葉牽牛(Ipomoeanil)等多種植物進(jìn)行研究表明，MYB是植物花青苷合成中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[34-35]。蘋果(Mulusdomestica)中MdMYB1可以正向調(diào)控果皮中MdDFR和MdANS的表達(dá)及花青苷的生物合成與積累[36]。葡萄(Vitisvinifera)中的VvMYB5a和VvMYB5b可以激活VvANS的啟動子從而調(diào)控漿果的花青苷合成與積累[37]?！畭u錦’牡丹(P.suffruticosa‘Shima Nishiki’)花發(fā)育的5個時期中轉(zhuǎn)錄因子PsMYB12L與DFR、ANS基因的表達(dá)模式相似，PsMYB12L上調(diào)這兩個基因的表達(dá)使花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加[10]。因此，推測MYB22可能是‘鳳丹’花青苷合成與積累中重要的轉(zhuǎn)錄因子。

轉(zhuǎn)錄因子bHLH最重要的功能之一就是調(diào)節(jié)花青苷合成[38]。在矮牽牛(Petuniahybrida)中bHLH基因Ahl可以調(diào)節(jié)PhDFRA的表達(dá)[39]。金魚草(Antirrhinummajus)中的Delila基因(bHLH基因)能促進(jìn)花青苷的合成[40]。具有與bHLH相互作用基序的MYB基因，可以形成MYB-bHLH復(fù)合物來調(diào)節(jié)花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[41]。石斛蘭(Dendrobiumhybrids)中DhMYB2與DhbHLH1相互作用以正向調(diào)控石斛蘭花瓣中的花素苷產(chǎn)生，影響花色[42]。菊花CmbHLH2與CmMYB6轉(zhuǎn)錄因子共表達(dá)時顯著上調(diào)CmDFR的表達(dá),并造成花青苷的積累[43]?！P丹’花中bHLH1的表達(dá)模式不僅與花青苷的變化趨勢，MYB22、DFR和ANS基因的表達(dá)模式一致，而且MYB22和bHLH1的表達(dá)量具有極顯著相關(guān)性。由此推測，bHLH1對‘鳳丹’花青苷合成起重要的調(diào)控作用，而且可能以MYB-bHLH復(fù)合物形式調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而影響‘鳳丹’花青苷的合成與積累。

綜上所述，‘鳳丹’牡丹花由紫紅色向白色變化主要是由于總花青苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的大量減少。推測開花過程中花青苷合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因PAL、DFR、ANS表達(dá)量的降低，使得‘鳳丹’牡丹花青苷的生物合成與積累減少，MYB22和bHLH1可能主要調(diào)控結(jié)構(gòu)基因DFR和ANS的表達(dá)，但具體的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。