趙倩倩，閆賴賴,2，解 清,2，劉雅瓊,2，楊思宇，郭 辰，王京宇, 2*

1. 北京大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗學系，北京 100191 2. 北京大學醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心生命元素組學實驗室，北京 100191

引 言

嗜酸乳桿菌是乳酸菌家族中極受重視的益生菌之一，被視為第三代酸乳發(fā)酵劑菌種[1-2]。嗜酸乳桿菌是胃和人體小腸內(nèi)的主要益生菌，釋放乳酸、乙酸和一些對有害菌起作用的抗菌素，抑制腸道不良微生物的增殖，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，具有營養(yǎng)、抗癌、增強機體免疫力與抗衰老等作用[3]。

嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，為革蘭氏陽性桿菌，形態(tài)呈細長桿狀，最適生長溫度為35～38 ℃，20 ℃以下不生長，耐熱性差[4]。最適pH為5.5～6.0，耐酸性強，能在其他乳酸菌不能生長的環(huán)境中生長繁殖[5]。能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進行同型發(fā)酵。

鋅(Zn)元素是人體生命代謝中非常重要的微量元素，是堿性磷酸酶、乙醇脫氫酶、氨基肽酶等多種生物酶類的重要輔基，參與糖類、脂類、蛋白質(zhì)的合成和降解等重要的新陳代謝過程，還可調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、程序性凋亡[6]，Zn在人體生命活動中發(fā)揮著至關重要的作用。然而Zn過量對細胞有毒害作用，主要是競爭性地與其他功能金屬離子的蛋白結(jié)合位點結(jié)合，使其失活并形成羥基自由基，對DNA、蛋白質(zhì)和脂類造成傷害[7]； 此外，高濃度Zn還會抑制電子傳遞鏈中的電子傳遞，從而影響呼吸作用，進而對生物體造成損傷[8]。

國內(nèi)對嗜酸乳桿菌單一菌種的研究還相對較少[9]，對微量元素與嗜酸乳桿菌之間的關系研究更是罕見。此外，現(xiàn)有相關研究還存在著元素刺激濃度不一致、涉及元素有限、實驗分組過少、缺乏重復實驗等不足。本研究以Zn為研究起點，設立多個實驗組，觀測培養(yǎng)液中不同濃度Zn對嗜酸乳桿菌生長速度的作用，并使用ICP-MS測定45種元素，以期得出更加全面的分析結(jié)果，從多元素層面探討對嗜酸乳桿菌生長產(chǎn)生作用的元素組及其可能的機制。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要設備

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)： 美國Perkin Elmer Sciex公司，ELAN DRC Ⅱ； 分光光度儀： HITACHI公司，U-3010。

1.1.2 主要試劑

(1)單元素標準溶液

Zn，Se和B等，濃度： 1 000 ng·mL-1，購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

(2)內(nèi)標溶液

Rh(1 000 ng·mL-1)，In(1 000 ng·mL-1)，Re(1 000 ng·mL-1)，購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

(3)標準物質(zhì)

豬肝(GBW10051)； 人發(fā)成分分析標準物質(zhì)(GBW09101a)； 人發(fā)成分分析標準物質(zhì)(GBW09101b)； 生物成分分析標準物質(zhì)。

(4)細菌菌種

嗜酸乳桿菌： CGMCC編號1.1878，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 方法

(1)實驗設計與分組

實驗包括1個對照組及6個實驗組，每組6個平行樣。培養(yǎng)液中Zn濃度分別為0，200，400，600，800，1 000和1 200 ng·mL-1，用超純水定容至40 mL。配制完成后高溫滅菌備用。

(2)嗜酸乳桿菌培養(yǎng)及其吸光度值測定

活化擴增嗜酸乳桿菌菌種，用分光光度儀于600 nm測量其吸光度(OD值)。待OD值穩(wěn)定在1±0.05時，取等量(100 μL)活化菌液接種于不同Zn濃度的MRS培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫搖床(100 r·min-1)培養(yǎng)。每2 h將各管培養(yǎng)液搖勻，定量吸取2 mL培養(yǎng)液于離心管中，再次搖勻后，取0.6 mL測定OD值，測定時使用的空白液與待測液的Zn濃度保持一致； 剩余1.4 mL經(jīng)離心后棄去上清液； 在沉淀中加入1.4 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)溶液輕搖洗滌，離心后棄上清液，再度重復上述步驟后，于沉淀物中加入100 μL濃硝酸，室溫下消化12 h； 消化液于-4 ℃冰箱保存，待測。

(3)儀器條件優(yōu)化及元素測定

經(jīng)優(yōu)化，分光光度儀、離心機、ICP-MS儀器參數(shù)分別列于表1—表3。

用標準物質(zhì)進行質(zhì)量控制，確保樣品前處理及檢測過程的可靠性與準確性； 在測量時加入內(nèi)標，以校正儀器的信號漂移。對于元素含量超出標準曲線上限的樣品，稀釋一定倍數(shù)后重新上機測定。

表1 分光光度計儀器參數(shù)Table 1 Spectrophotometer instrument parameters

表2 離心機儀器參數(shù)Table 2 Centrifuge instrument parameters

表3 ICP-MS儀器參數(shù)Table 3 Instrument parameters of ICP-MS

將冷消化后的細菌樣品從冰箱取出后，室溫下解凍，在每個待測樣品(0.1 mL)中準確加入0.1 mL混合內(nèi)標(Rh： 20 ng·mL-1，In： 2 ng·mL-1，Re： 2 ng·mL-1)和1.8 mL超純水，充分混勻后離心，測定上清液中無機元素含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用重復測量資料分析方法比較各組間OD值及元素含量的差異，元素含量與OD值之間的相關性采用Spearman分析； 各元素含量間的相關性采用偏相關分析。以上統(tǒng)計方法，均設定雙側(cè)p<0.05時為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 Zn濃度對嗜酸乳桿菌生長速度的影響

每隔2 h測定一次嗜酸乳桿菌菌液OD值，獲取嗜酸乳桿菌生長曲線。如圖1和圖2所示，隨著培養(yǎng)液Zn濃度上升，嗜酸乳桿菌生長刺激反應幅度逐漸增強，并在Zn濃度為600 ng·mL-1時達到最大值； 隨著Zn濃度繼續(xù)增加，嗜酸乳桿菌生長的刺激反應幅度逐漸減弱； 當Zn濃度上升到1 000 ng·mL-1時，Zn對嗜酸乳桿菌的生長已出現(xiàn)抑制效應。這與稀土元素的Hormesis效應相似，即低劑量促進高劑量抑制的效應[10]。Zn的刺激作用可能與氧化還原酶、水解酶、轉(zhuǎn)移酶、裂合酶、連接酶、異構(gòu)酶等含鋅金屬酶的作用有關，非致病性異養(yǎng)菌中鋅金屬蛋白酶的主要功能是水解環(huán)境中蛋白或多肽，以獲得氨基酸作為養(yǎng)料。細菌還有高親和力的Zn2+轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，用以獲取足夠的Zn2+ [11]。

既往關于Zn毒性研究多集中在對動物機體各方面的毒性作用，給動物補充過量的Zn時，會出現(xiàn)中毒癥狀，對消化系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、生殖和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用[12]。過量的Zn不僅對動物機體產(chǎn)生不良影響，對細菌也具有毒性作用，細菌通過一些特有的機制來解除重金屬離子對它們的毒害，主要包括外排機制，螯合機制和外排后結(jié)合機制[13]。上述機制或許能夠部分解釋Zn過量后對于嗜酸乳桿菌生長的抑制作用。

本研究顯示，嗜酸乳桿菌在含Zn培養(yǎng)液中的生長曲線呈倒U字型(圖2)，在Zn濃度為600 ng·mL-1時到達頂點，這一結(jié)果對在嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液中添加微量元素以控制其生長速度具有參考價值。

通過比較600 ng·mL-1Zn濃度組與對照組在各個時間點的OD值，獲得了本實驗中Zn對嗜酸乳桿菌生長的最大刺激反應幅度(見表4)。計算公式為(ODmax-OD對照)/OD對照。

圖1 嗜酸乳桿菌部分實驗組生長曲線圖Fig.1 Lactobacillus acidophilus growth curve of partial group

2.2 嗜酸乳桿菌生長速度與菌體內(nèi)元素含量的相關性

實驗測定了45種元素的含量，去除15種未達到檢出限的元素，得到30種元素的定量數(shù)據(jù)(表5)。對單位OD值下嗜酸乳桿菌菌體各元素含量與OD值進行Spearman非參數(shù)相關分析。結(jié)果顯示，Zn，Rb，Ti和Ag在所設計的5個時間點均有統(tǒng)計學意義，Se，Sr和Sb在4個時間點有統(tǒng)計學意義，Al，Mn，F(xiàn)e，Co，Cd和Ba在3個時間點有統(tǒng)計學意義； 2～10 h整體分析結(jié)果中，除La以外，其他元素的含量值與OD值的相關系數(shù)均具有統(tǒng)計學意義。由表5初次觀察到，Se，F(xiàn)e，Mn，Co，Zn和Sr等有益元素含量值與OD值之間呈正相關，而U，Al，Ti，Sb和Pb等有害元素則為負相關。上述結(jié)果首次將嗜酸乳桿菌生長速度與菌體內(nèi)有益元素和有害元素含量聯(lián)系在一起，并由此或許可以得出導致嗜酸乳桿菌生長速度提升的潛在機制假設： 適當量的Zn干預可以刺激桿菌吸收有益元素，阻礙有害元素的吸收，進而加速嗜酸乳桿菌生長。上述假設需要進一步實驗加以驗證。

圖2 嗜酸乳桿菌各實驗組生長曲線Fig.2 Growth curve of all groups of Lactobacillus acidophilus

表4 鋅對嗜酸乳桿菌的最大刺激反應幅度Table 4 The maximum stimulation response ofzinc to Lactobacillus acidophilus

在控制OD值的條件下，各時間點嗜酸乳桿菌中各元素含量與Zn含量之間的相關性偏相關分析結(jié)果如表6所示： Cu，Rb，Mn，Se，Sr和U在4個時間點有統(tǒng)計學意義，F(xiàn)e，Co，Cd在3個時間點有統(tǒng)計學意義； Cu，Cd，Mo和U的在部分時間點呈負相關，其余時間點及其他元素均為正相關； Zn與Se含量之間相關系數(shù)為0.726，Zn與其他元素相關系數(shù)介于0.4～0.6之間。

表5 元素含量與OD值相關分析結(jié)果Table 5 Analysis of correlation between element content and OD value

續(xù)表5

La0.2340.455??0.403??0.0950.092-0.016Ce-0.338?-0.398??-0.399??-0.1010.278-0.356??Pr-0.184-0.136-0.264-0.207-0.087-0.406??Nd-0.186-0.27-0.2720.192-0.02-0.466??Sm-0.133-0.125-0.2540.166-0.13-0.408??Eu-0.168-0.213-0.309?0.193-0.116-0.130?Gd-0.263-0.308?-0.322?-0.0100.088-0.466??Li-0.421??-0.1590.130-0.033-0.065-0.338??B0.181-0.245-0.113-0.278-0.317?-0.200??Al-0.251-0.466??-0.494??-0.288-0.506??-0.557??Ti-0.556??-0.449??-0.472??-0.387??-0.579??-0.552??Cr0.1990.136-0.245-0.1000.138-0.278??Mn0.1600.374?0.409??0.2570.301?0.512??Fe0.2650.397??0.311?0.1880.332??0.569??Co0.0720.321?0.513??0.1160.391??0.439??Ni0.186-0.321?-0.464??-0.078-0.276-0.404??Ge0.084-0.267-0.251-0.058-0.151-0.439??Se0.2680.468??0.599??0.304?0.342?0.656??Sr-0.313?-0.371??-0.476??-0.224-0.641??-0.307??Mo0.1290.026-0.335?-0.0230.184-0.321??Ag-0.455??-0.715??-0.791??-0.538??-0.449??-0.593??Cd-0.595??-0.443??-0.164-0.228-0.394??-0.364??Sb-0.531??-0.352?-0.456??-0.516??-0.240-0.540??Ba-0.361?-0.502??-0.302?-0.184-0.180-0.540??Th-0.1350.029-0.214-0.0490.032-0.303??U-0.714??-0.475??-0.544??-0.294-0.677??-0.585??

注： **表示在置信度(雙側(cè))為0.01時，達到顯著的相關； *表示在置信度(雙側(cè))為0.05 時，達到相關； “-”表示負相關。

表6 菌體內(nèi)Zn與其他元素含量相關分析結(jié)果Table 6 Elemental content-Zn content correlation analysis results

續(xù)表6

Cd-0.010-0.398?-0.617??-0.314-0.558??-0.594??Sb-0.0130.640??0.2720.446??0.1620.398?Ba0.0260.526??0.3300.484??0.2540.311Th-0.2470.0510.1010.103-0.036-0.035U-0.080-0.593??-0.587??-0.524??-0.652??-0.426??

注： **表示在置信度(雙側(cè))為0.01時，達到顯著的相關； *表示在置信度(雙側(cè))為0.05時，達到相關； “-”表示負相關。

3 結(jié) 論

根據(jù)實驗結(jié)果得出如下主要結(jié)論： (1)培養(yǎng)液中Zn的濃度變化會對嗜酸乳桿菌生長產(chǎn)生刺激效應，并在Zn濃度為600 ng·mL-1時達到最大值。(2)培養(yǎng)液中添加Zn可以調(diào)節(jié)嗜酸乳桿菌菌體內(nèi)有益與有害元素的吸收，菌體內(nèi)無機元素的再平衡或許是Zn干預提升嗜酸乳桿菌生長速度的潛在機制。