徐川東，孟艷秋

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110142)

惡性腫瘤對(duì)人類健康具有極大危害，從天然產(chǎn)物中提取有效成分并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾改造已成為近年來抗腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)熊果酸可作用于腫瘤的不同階段.熊果酸又叫烏索酸和烏蘇酸，是廣泛存在于自然界植物中的一種五環(huán)三萜類化合物，熊果酸具有抗腫瘤[1]、抗肝炎[2]、抗菌消炎[3]、抗病毒[4]、抗艾滋病[5]、降血糖血脂[6]、抗糖尿病[7]、鎮(zhèn)靜[8]等活性.研究發(fā)現(xiàn),熊果酸還具有抗致癌、抗突變、抗促癌、誘導(dǎo)F9畸胎瘤細(xì)胞分化分裂和抗血管生成的作用，因此極有可能成為低毒高效的新型防癌抗癌藥物[9].熊果酸在抗腫瘤上的良好藥理活性并沒使其成為臨床上使用的抗腫瘤藥物，主要是因?yàn)樾芄嶙陨斫Y(jié)構(gòu)導(dǎo)致其水溶性較差，生物利用度偏低.所以實(shí)驗(yàn)組對(duì)熊果酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，期望能改善其缺點(diǎn)，使其能應(yīng)用于臨床研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Büchi B-540型熔點(diǎn)測(cè)定儀，瑞士Büchi公司；Bruker ARX-600型核磁共振分析儀，瑞士Bruker公司，CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)；LCQ型質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher Scientific-Finnigan.所有試劑均為分析純或化學(xué)純.

1.2 新型熊果酸衍生物的合成

Dar[10]將熊果酸(UA)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，得到的熊果酸衍生物抗腫瘤活性非常好.實(shí)驗(yàn)組以熊果酸為先導(dǎo)化合物，引入與其類似基團(tuán)，將C-28位羧基成酯，最終合成5種新型熊果酸衍生物，具體合成路線如下：

其中：

Ⅰ1: R1=CH2CH3，Ⅰ2: R1=CH2CH2CH3，

Ⅰ3: R1=CH2CH2CH2CH3，

Ⅰ4: R1=CH2CH2CH2CH2CH3，

Ⅰ5: R1=CH2CH2CH2CH2CH2CH3.

1.2.1 3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸(UA1)的合成

將UA溶解于二氯甲烷中，在冰水浴下緩慢滴加新配置的瓊斯試劑，自然恢復(fù)至室溫反應(yīng)2 h,TLC時(shí)刻檢測(cè)反應(yīng)是否完畢，確定反應(yīng)結(jié)束后滴加適量異丙醇將剩余氧化劑進(jìn)行淬滅,乙酸乙酯(EA)及飽和食鹽水進(jìn)取，無水硫酸鈉進(jìn)行干燥,最后抽濾得到粗品，柱層析得白色的UA1，產(chǎn)率為80.42 %,m.p.233.3～234.6 ℃.

1.2.2 2-苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸(UA2)的合成

將UA1和苯甲醛加入50 mL茄形瓶中，乙醇為溶劑，KOH為催化劑，在80 ℃下回流8 h，TLC測(cè)試反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束.首先取乙酸乙酯以及飽和食鹽水進(jìn)行萃取，再用無水硫酸鈉干燥,最后抽濾旋蒸，快速柱層析得棕黃色的UA2，產(chǎn)率為76.32 %,m.p.143.3～145.6 ℃.

1.2.3 2-苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸乙酯(Ⅰ1)的合成

將UA2和溴乙烷置于50 mL茄形瓶中，DMF為溶劑，無水碳酸鉀為催化劑，室溫反應(yīng)，TLC測(cè)試反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束.使用乙酸乙酯和飽和食鹽水進(jìn)行萃取，再采用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥,最后抽濾旋蒸，柱層析得黃色的Ⅰ1，產(chǎn)率為76.41 %,m.p.148.7～150.4 ℃.ESI-MS，m/z:570.4[M+H]+.1H-NMR(CDCl3,400 MHz)，δ:7.62(dd,J=5.2,2.5 Hz,2H,H-Ph),7.49～7.40(m,2H,H-Ph),7.34(d,J=1.6 Hz,1H,H-Ph),7.30(s,1H,Ph-CH),5.23(s,1H,H-12),4.06～3.97(m,2H,COOCH2),2.52(dt,J=13.9,7.2 Hz,1H,H-18),1.25～1.18(m,6H,CH3,CH2CH3),1.09～1.02(m,6H,CH3×2),0.98(s,3H,CH3),0.92(d,J=5.2 Hz,3H,CH3),0.86～0.81(m,3H,CH3),0.80(s,3H,CH3).

1.2.4 2-苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丙酯(Ⅰ2)的合成

用1.2.3的方法，UA2與溴丙烷反應(yīng)制得Ⅰ2，產(chǎn)率為80.26 %,m.p.152.5～154.1 ℃.ESI-MS,m/z:584.9[M+H]+.1H-NMR(CDCl3,400 MHz)，δ:7.65(d,J=2.7 Hz,2H,H-Ph),7.42(d,J=1.4 Hz,2H,H-Ph),7.28(d,J=5.7 Hz,1H,H-Ph),7.19(s,1H,Ph-CH),5.20(s,1H,H-12),4.02(d,J=4.7 Hz,2H,COOCH2),2.58～2.52(m,1H,H-18),1.73(m,2H,COOCH2CH2),1.28(d,J=9.9 Hz,3H,CH3),1.24(d,J=3.9 Hz,3H,CH3),1.13(d,J=11.6 Hz,3H,CH3),1.06(s,3H,CH3),1.01(s,3H,CH3),0.99～0.95(m,3H,CH3),0.93(m,3H,CH2CH3),0.87(s,3H,CH3).

1.2.5 2-苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丁酯(Ⅰ3)的合成

用1.2.3的方法，UA2與1-溴正丁烷反應(yīng)制得Ⅰ3，產(chǎn)率為73.91 %,m.p.157.2～159.8 ℃.ESI-MS,m/z:598.5[M+H]+.1H-NMR(CDCl3,400 MHz)，δ:7.92(d,J=7.1 Hz,2H,H-Ph),7.76～7.68(m,2H,H-Ph),7.53(d,J=7.0 Hz,1H,H-Ph),7.23(s,1H,Ph-CH),5.16(s,1H,H-12),3.97～3.87(m,2H,COOCH2),2.68(d,J=20.4 Hz,1H,H-18),1.69(dd,J=29.2,10.1 Hz,2H,COOCH2CH2),1.41(d,J=5.6 Hz,2H,COOCH2CH2CH2),1.34～1.28(m,3H,CH3),1.20(dd,J=17.6,6.3 Hz,3H,CH3),1.14～1.03(m,9H,CH3×3),0.95～0.88(m,3H,CH2CH3),0.84(s,3H,CH3),0.76(s,3H,CH3).

1.2.6 2-苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸戊酯(Ⅰ4)的合成

用1.2.3的方法，UA2與1-溴正戊烷反應(yīng)制得Ⅰ4，產(chǎn)率為76.56 %,m.p.161.1～163.2 ℃.ESI-MS,m/z:612.4[M+H]+.1H-NMR(CDCl3,400 MHz)，δ:7.78～7.50(m,2H,H-Ph),7.52～7.40(m,2H,H-Ph),7.32(d,J=6.2 Hz,1H,H-Ph),7.06(s,1H,Ph-CH),5.26(t,J=3.0 Hz,1H,H-12),4.02～3.90(m,2H,COOCH2),2.64～2.30(m,1H,H-18),1.86～1.62(m,2H,COOCH2CH2),1.35～1.30[m,4H,COOCH2CH2(CH2)2],1.15～1.00(m,3H,CH3),1.12(d,J=5.8 Hz,6H,CH3×2),0.95(s,3H,CH3),0.92～0.85(m,6H,CH3,CH2CH3),0.82～0.73(m,6H,CH3×2).

1.2.7 2-苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸己酯(Ⅰ5)的合成

用1.2.3的方法，UA2與1-溴正己烷反應(yīng)制得Ⅰ5，產(chǎn)率為79.17 %,m.p.164.1～166.7 ℃.ESI-MS,m/z:626.4[M+H]+.1H-NMR(CDCl3,400 MHz)，δ:7.76～7.70(m,2H,H-Ph),7.50(d,J=4.6 Hz,2H,H-Ph),7.40～7.32(m,1H,H-Ph),7.26(s,1H,Ph-CH),5.30～5.23(m,1H,H-12),4.12(d,J=5.2 Hz,2H,COOCH2),2.66～2.51(m,1H,H-18),1.68～1.56[m,8H,COOCH2(CH2)4],1.48(t,J=8.2 Hz,3H,CH3),1.34(d,J=18.4 Hz,12H,CH3×4),1.15(s,3H,CH3),0.92(s,3H,CH2CH3),0.85(d,J=5.1 Hz,3H,CH3).

2 抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選用的腫瘤細(xì)胞是人胃癌細(xì)胞SGC-7901以及人肝癌細(xì)胞BEL-7402，而VP-16(依托泊苷)在臨床主要用于治療肺癌、胃癌和食管癌，故選擇VP-16作為陽性對(duì)照藥，以MTT法對(duì)合成的產(chǎn)物進(jìn)行體外抗腫瘤活性測(cè)試.將生長至對(duì)數(shù)生長期的兩種腫瘤細(xì)胞消化并離心，制備成細(xì)胞懸液.將兩種細(xì)胞的細(xì)胞密度調(diào)節(jié)到2×104個(gè)/mL.在96孔板中每孔接種180 μL，需要注意，在保證鋪板速度的前提下，要使細(xì)胞密度更為均勻，如果能做到每個(gè)孔內(nèi)的數(shù)量相差無幾最好.結(jié)束鋪板后，將孔板處于特定環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育一段時(shí)間.配置藥物是用培養(yǎng)基作為溶劑，藥物質(zhì)量濃度分別為33 g/L、11 g/L、3.6 g/L、1.2 g/L和0.4 g/L.向孔板中注入藥液，不同的孔板中加入不同劑量和質(zhì)量濃度的藥液.加藥結(jié)束后將其在特定環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間.等待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束，舍棄孔板中的培養(yǎng)基，在每一個(gè)孔板中加入配置的特定質(zhì)量濃度的噻唑藍(lán)溶液，繼續(xù)進(jìn)行孵育.等待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束，舍棄孔板中的噻唑藍(lán)溶液.配置特定濃度的二甲基亞砜，以相同的濃度和特定的劑量加入到每一個(gè)孔板中，待結(jié)晶甲瓚完全溶解后，將該板放置于酶標(biāo)儀490 nm處觀察其吸光度，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值.不同化合物對(duì)BEL-7402和SGC-7901細(xì)胞的抑制率和IC50見表1.由表1可知：所得產(chǎn)物對(duì)BEL-7402以及SGC-7901細(xì)胞都具有較好的抑制效果，產(chǎn)物相對(duì)于UA的抑制活性有較大提高，所得產(chǎn)物對(duì)于SGC-7901和BEL-7402細(xì)胞的IC50相當(dāng)或是略強(qiáng)于VP-16，藥理活性較好.

表1 目標(biāo)化合物對(duì)BEL-7402細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞的抗癌活性

注：*化合物濃度為10 μmol/L,經(jīng)過48 h處理后的細(xì)胞抑制率.

3 結(jié)果與討論

將熊果酸的C-3位羥基氧化成羰基，再將C-2位與苯甲醛進(jìn)行羥醛縮合，最后將C-28的羧基與溴代烷反應(yīng)得到5個(gè)新型熊果酸衍生物，體外活性測(cè)試對(duì)BEL-7402和SGC-7901細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的抑制作用，隨著C-28位烷基側(cè)鏈的長度增長其活性也隨之有所增強(qiáng).改造后，A環(huán)羰基與引入基團(tuán)形成了電子云密度較高的大π鍵，能與特定腫瘤細(xì)胞更好地結(jié)合，產(chǎn)生更好的抗腫瘤藥理活性.該結(jié)論對(duì)熊果酸進(jìn)行進(jìn)一步的研究及其衍生物結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和優(yōu)化具有一定的參考價(jià)值.