趙楠　景云榮　何婷婷　柴軍紅　宛春雷　張蕾

摘要：以蕓香科吳茱萸屬植物吳茱萸（Evodia rutaecarpa）為原料，吳茱萸總黃酮的含量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化總黃酮的提取工藝。所得最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、固液比1∶50、提取時(shí)間40 min、提取溫度65 ℃，在此條件下總黃酮得率為8.82%。DPPH·自由基清除試驗(yàn)評(píng)價(jià)吳茱萸總黃酮體外抗氧化活性表明，吳茱萸總黃酮具有良好的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：吳茱萸（Evodia rutaecarpa）;總黃酮;提取工藝;抗氧化活性

中圖分類號(hào)：R284.2;S567.1+9? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）03-0118-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.03.025

Study on extracting and antioxidant activity of total flavonoids from Evodia rutaecarpa

ZHAO Nan，JING Yun-rong，HE Ting-ting，CHAI Jun-hong，WAN Chun-lei，ZHANG Lei

（Mudanjiang Normal University，Mudanjiang 157011，Heilongjiang，China）

Abstract： Taking Evodia rutaecarpa as raw materials， and total flavonoids content as the index， on the basis of single factor experiment， the optimization of extraction of flavonoids from Evodia rutaecarpa was investigated by orthogonal experimental design. The optimum conditions were ethanol concentration at 70%， solid-liquid ration at 1∶50， extraction time at 40min and extraction temperature at 65℃. The results showed that the extracting rate of total flavonoids reached 8.82%. The antioxidant activity of flavonoids from Evodia rutaecarpa had good ability to scavenge DPPH· free radical.

Key words： Evodia rutaecarpa; total flavonoids; extract process; antioxidant activity

吳茱萸（Evodia rutaecarpa）為蕓香科植物吳茱萸、石虎或疏毛吳茱萸的干燥成熟果實(shí)，是中國傳統(tǒng)中藥，貴州道地藥材[1]，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉等功效[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，吳茱萸具有抗炎鎮(zhèn)痛[3]、降壓[4]、抗腫瘤[5]、心肌保護(hù)[6]等多種作用。吳茱萸的化學(xué)成分豐富，主要包括生物堿[7]、檸檬苦素[8]、黃酮[9]、揮發(fā)油[10]等，其中對(duì)生物堿類成分的研究最為深入，而對(duì)吳茱萸中黃酮類成分研究較少。吳茱萸中黃酮類成分主要為黃酮及其苷類，其結(jié)構(gòu)豐富多樣，為吳茱萸藥材的藥理活性奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。目前對(duì)于吳茱萸中總黃酮及其抗氧化活性的研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)以吳茱萸藥材為原料，通過超聲提取法研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)吳茱萸中總黃酮得率的影響，應(yīng)用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化提取總黃酮的工藝，通過清除DPPH·自由基法評(píng)價(jià)吳茱萸總黃酮的抗氧化活性，以期為吳茱萸的資源開發(fā)與合理利用提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 吳茱萸購于河北安國藥材市場(chǎng)，粉碎備用。乙醇（分析純，天津進(jìn)風(fēng)化工有限公司），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%，貴州迪大科技有限公司），NaNO2（天津市大茂化學(xué)試劑廠），Al（NO3）3（天茂化工有限公司）。

1.1.2? 主要儀器? 紫外分光光度計(jì)（普析通用儀器有限責(zé)任公司），電子分析天平（塞利多斯科學(xué)儀器有限公司），超聲清洗儀（標(biāo)和儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Yamato科技貿(mào)易有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 總黃酮的提取? 吳茱萸果實(shí)干燥后，粉碎過篩，準(zhǔn)確稱取1.0 g粉末置于錐形瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在一定溫度下，超聲波輔助法加熱提取。

1.2.2? 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制? 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品恒溫干燥后，精密稱取20.0 mg，60%乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，制成0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL具塞比色管中，再依次分別加入4.0、3.0、2.0、1.0、0.0 mL 30%乙醇，每個(gè)具塞比色管中加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min后，再加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min后，再加入1 mol/L的NaOH溶液4.0 mL，30%乙醇定容至10 mL，搖勻后靜置15 min，于510 nm下測(cè)定吸光度。

1.2.3? 總黃酮的檢測(cè)? 準(zhǔn)確吸取“1.2.1”提取溶液? 1 mL，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的步驟，在510 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮得率。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4? 單因素試驗(yàn)

1）乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇。固定提取溫度為50 ℃、固液比為1∶30、提取時(shí)間30 min的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、40%、60%、80%、90%，研究不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)吳茱萸中總黃酮得率的影響。

2）固液比的選擇。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、提取時(shí)間為30 min、提取溫度為50 ℃，按照固液比分別為1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶90，研究固液比對(duì)吳茱萸中總黃酮得率的影響。

3）提取時(shí)間的選擇。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、固液比為1∶40、提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間分別為15、30、45、60、75 min，研究不同提取時(shí)間對(duì)吳茱萸中總黃酮得率的影響。

4）提取溫度的選擇。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、固液比為1∶40、提取時(shí)間為45 min，提取溫度分別為30、40、50、60、70 ℃，研究不同提取溫度對(duì)吳茱萸中黃酮得率的影響。

1.2.5? 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取時(shí)間、提取溫度為試驗(yàn)因素，以總黃酮得率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34）優(yōu)化總黃酮的提取工藝。試驗(yàn)的因素與水平見表1。

1.2.6? 抗氧化活性? 參考文獻(xiàn)[11]的方法并稍加改動(dòng)，以抗壞血酸為對(duì)照，在具塞比色管中依次加入0.2 mmol/L的DPPH·溶液2 mL、無水乙醇2 mL和不同濃度的抗壞血酸溶液或吳茱萸黃酮溶液2 mL，混勻后，避光放置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度A0、A1、A2，重復(fù)試驗(yàn)3次，計(jì)算不同濃度下對(duì)DPPH·的清除率。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 線性關(guān)系考察

依據(jù)“1.2.2”項(xiàng)下方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度（y）對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（x）進(jìn)行線性回歸。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在0.01～0.05 mg/mL與吸光度相關(guān)性良好，回歸方程為y=1.272 x-0.001，R2=0.999 8。

2.2? 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1? 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)吳茱萸總黃酮得率的影響? 由圖1可知，吳茱萸中總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，吳茱萸總黃酮得率最高，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，得率開始趨向于平緩并略有降低，可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)過高導(dǎo)致極性較大的黃酮溶解度降低。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%～90%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.2? 固液比對(duì)吳茱萸總黃酮得率的影響? 由圖2可知，在固液比為1∶40時(shí)，吳茱萸總黃酮的得率達(dá)到最大，提取溶劑的量增加后，總黃酮得率反而降低，提取時(shí)間也相應(yīng)延長，在限定的時(shí)間內(nèi)得率有所下降。因此，選擇固液比1∶30～1∶40進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3? 提取時(shí)間對(duì)吳茱萸總黃酮得率的影響? 由圖3可知，在提取時(shí)間小于45 min時(shí)，總黃酮得率隨提取時(shí)間增加而增大，當(dāng)提取時(shí)間大于45 min后，總黃酮得率有下降趨勢(shì)，可能是由于提取時(shí)間增加，黃酮苷類被水解，所以吸光度有所下降。因此，選擇40～50 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.4? 提取溫度對(duì)吳茱萸總黃酮得率的影響? 由圖4可知，吳茱萸總黃酮吸光度隨提取溫度的升高而增大，當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，吳茱萸中總黃酮得率達(dá)到最大，在提取溫度為70 ℃時(shí)，開始趨向于平緩并且略有降低，可能是由于溫度過高，乙醇揮發(fā)較多，同時(shí)對(duì)熱不穩(wěn)定的黃酮被破壞，降低了總黃酮得率。因此，選擇55～65 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3? 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇4因素3水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34），優(yōu)化吳茱萸中總黃酮的提取工藝，考察指標(biāo)為總黃酮得率，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，各提取因素的影響順序?yàn)樘崛囟?固液比>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)，正交試驗(yàn)最佳工藝為A1B3C1D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，固液比1∶50，提取時(shí)間40 min，提取溫度65 ℃。在最優(yōu)工藝參數(shù)下，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證工藝穩(wěn)定性。取待測(cè)樣品5份，測(cè)試總黃酮平均得率為8.82%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.13%，表明該工藝參數(shù)較穩(wěn)定。

2.4? 抗氧化活性結(jié)果

以抗壞血酸為對(duì)照，DPPH·清除能力的測(cè)定結(jié)果見圖5。由圖5可知，在濃度小于0.015 mg/mL時(shí)，吳茱萸總黃酮對(duì)DPPH·的清除率略優(yōu)于抗壞血酸，表明吳茱萸總黃酮具有良好的抗氧化活性。

3? 小結(jié)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用超聲提取法，通過正交試驗(yàn)對(duì)吳茱萸中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到吳茱萸總黃酮提取的最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、固液比1∶50、提取時(shí)間40 min，提取溫度65 ℃，總黃酮得率為8.82%，且該工藝具有良好的穩(wěn)定性。同時(shí)，通過測(cè)試清除DPPH·自由基能力，以抗壞血酸為對(duì)照評(píng)價(jià)吳茱萸總黃酮的抗氧化活性，結(jié)果表明，吳茱萸總黃酮對(duì)DPPH·自由基清除能力略優(yōu)于抗壞血酸。研究首次采用超聲提取法對(duì)吳茱萸藥材中總黃酮的提取工藝及其體外抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為吳茱萸藥材的開發(fā)利用以及后續(xù)研究提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大詞典上冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1977.1118-1120.

[2] 高學(xué)敏.中藥學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2002.278-279.

[3] KOBAYASHI Y. The nociceptive and anti-nociceptive effects of evodiamine from fruits of Evodia rutaecarpa in mice[J].Planta medica，2003，69：425-428.

[4] 龔慕辛，王智民，張啟偉，等.吳茱萸有效成分的藥理研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理，2009，20（2）：183-187.

[5] GI K，LIN S，LEE C C，et al. Evodiamine inhibits in vitro angiogenesis：Implication for antitumorgenicity[J].Life sciences，2006， 78：2234-2243.

[6] 許青媛，楊甫昭，陳春梅.吳茱萸溫通血脈的藥理研究[J].中藥藥理與臨床，1994（2）：35-37.

[7] ZHAO N，LI Z L，LI D H，et al. Quinolone and indole alkaloids from the fruits of Euodia rutaecarpa and their cytotoxicity against two human cancer cell lines[J].Phytochemistry，2015，109：133-139.

[8] 趙? 楠，李達(dá)翃，李占林，等.吳茱萸化學(xué)成分的分離與鑒定[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016（2）：103-109.

[9] 趙? 楠，李占林，李達(dá)翃，等.吳茱萸中1個(gè)新的苯丙素苷類化合物[J].中草藥，2015，46（1）：15-18.

[10] 王? 銳，倪京滿，馬? 星.中藥吳茱萸揮發(fā)油成分的研究[J].中國藥學(xué)雜志，1993，28（1）：16-18.

[11] 艾? 薇，李? 悅，匡建秋.藿香葉黃酮提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性[J].食品工業(yè)而科技，2018，39（22）：187-191.

收稿日期：2019-05-06

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳項(xiàng)目（1354MSYYB004）;牡丹江師范學(xué)院科研項(xiàng)目（QN2019004）;牡丹江市科技攻關(guān)項(xiàng)目（Z2018S070）;黑龍江省北方藥食技術(shù)工程中心專項(xiàng)（PT2018011）

作者簡介：趙? 楠（1989-），女，黑龍江牡丹江人，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，（電話）13845302432（電子信箱）swxzn0@126.com。